Virus levering CRISPR guider til Murine prostata for Gene endring
Summary
Denne protokollen beskriver en nyetablerte metode for virus levering til murine prostata. Bruker enten CRISPR/Cas9 teknologi, gene overuttrykte eller grobunn recombinase levering, teknikken tillater orthotopic endring av genuttrykk og implementerer en ny musemodell for prostatakreft.
Abstract
Med et økende forekomst av prostatakreft er identifisering av nye svulst drivere eller modulatorer avgjørende. Genmodifiserte musen modeller (GEMM) for prostatakreft er hemmet av svulst heterogenitet og dets komplekse microevolution dynamikk. Tradisjonelle prostatakreft musen modeller inkluderer, blant annet germline og betinget knockouts, transgene uttrykk for oncogenes og xenograft modeller. Generasjon av de novo mutasjoner i disse modellene er komplekse, tidkrevende og kostbare. I tillegg rette de fleste av tradisjonelle modeller flertallet av prostata epitel, mens menneskelig prostata kreft er kjent for å utvikle seg som en isolert begivenhet i bare en undergruppe av celler. Verdifulle modeller må simulere ikke bare prostatakreft innvielsen, men også progresjon til avansert sykdom.
Her beskriver vi en metode for å målrette noen celler i prostata epitel av transducing celler av virus partikler. Levering av en konstruert virus til murine prostata tillater endring av genuttrykk i prostata epithelia. Virus type og antall definerer herved antall målrettet celler for genet endring av transducing noen celler for kreft initiering og mange celler for genterapi. Gjennom kirurgi-baserte injeksjon i fremre flik, distale fra urin spor, kan svulst i denne modellen utvide uten at dette skader funksjonen urin av dyret. Videre av målretting bare et delsett av prostata epitelceller teknikken gjør klonal ekspansjon av svulsten, og derfor etterligner menneskelige svulst innvielsen, progresjon, samt invasjonen gjennom basale membran.
Denne teknikken gir en kraftig prostatakreft modell forbedret fysiologiske relevans. Dyr lider er begrenset, og siden det kreves ingen ekstra avl, samlet dyr antall reduseres. Samtidig, er analyse av ny kandidat gener og veier akselerert, som er mer kostnadseffektivt.
Introduction
Oppdagelse og behandling av prostatakreft har forbedret det siste tiåret. Likevel, er forekomsten av prostatakreft er økende, etter levealder. Med en anslått 1,1 millioner nye tilfeller på verdensbasis er blant de vanligste årsakene til kreft-relaterte dødsfall i menn 1. Prostatakreft er treg i sin utvikling, men når kreften har kommet til en avansert metastatisk tilstand, prognosen er dårlig på grunn av begrenset behandlingstilbud. Så langt bare noen gener har blitt identifisert som vanlige drivere i denne kreft, og heterogenitet og multifocality hindrer oppdagelsen av biomarkers og targetable sykdom drivere2,3.
Klassiske teknikker for genererer GEMMs er ofte nedsatt av sin kompleksitet, betimelig utgifter og kostnader. Betinget knockout modeller har vært mye brukt til å studere prostatakreft kandidat gener, som resulterer i embryonale dødelighet når inaktivert i germline4. Vanligste modeller innebære en prostata-spesifikt grobunn recombinase drevet av enten en modifisert Probasin5 eller en PSA6 promoter integrert i GEMM flere krysset-formering. I disse modellene, skal genet av interesse nås i de fleste prostata epitelceller, generere hyperplasia i hele orgel, som kan forringe dyrets urinveisinfeksjon funksjon7.
Viral levering av grobunn protein ved injeksjon i den fremre lobe av murine prostata kan løse dette problemet ved bare målretting noen celler8. Hensyntatt laboratorier tekniske forutsetninger, ekspertise og mål, metoden fordelene fra et bredt spekter av mulige variasjoner. Vellykkede tilnærminger utnytte Adenovirus rettet mot JunB og Pten9 eller Lentivirus rettet mot Pten og Trp5310 vist seg blant andre. Legger til effekter av transgener, som luciferase, viral Konstruer eller GEMM gjør videre ikke-invasiv overvåking av sykdomsprogresjon via bioluminescens imaging11.
Genomet redigering basert på CRISPR/Cas9 teknologi avslører en ny og rask mulighet til å studere kreft gjennom rask generasjon somatiske fortrenging12. Viral levering av enkelt guide RNAs (sgRNAs) til den fremre flik av murine prostata etablerer en fysiologisk mer relevante modell av prostatakreft. På denne måten, kan enkeltceller bærer valgte mutasjoner danne kloner som kan ekspansjon og invasjon. Videre genererer bruk av guide RNAs for flere mål gener cellen kloner med endringer i ulike gener. Dette vil tillate svulst heterogenitet og en naturlig utvalg press på kreft progresjon, som kan avsløre betydningen av hver genet endring eller epistatic mekanismer.
Her presenterer vi en metode for å levere virus partikler til murine prostata for endring av genuttrykk. En liten mage snitt, den murine fremre prostata lobe er utsatt og virus partikler som injiseres i lobe. Fem dager etter operasjonen, kirurgisk klipp kan fjernes fra huden og prostatic kreft kan analyseres fra 8 uker etter. Samlet sett er dette en rask og kostnadseffektiv prosedyre, som har liten effekt på musen og tillater større svulst å utvikle uten at musen.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne protokollen beskriver vi en metode for å endre genuttrykk i fremre flik av murine prostata ved virus injeksjon, opprette en kraftig ny musemodell for prostatakreft (figur 2). Vellykket administrasjonen av en Adenovirus ble først beskrevet av Leow et al. i 20058. Vi har tidligere vist hvordan en Adenovirus koding for en grobunn recombinase protein kan erstatte tidkrevende krysset-formering av en grobunn allelet for vev-spesifikke sletting <sup class=…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MR ble finansiert av et fellesskap fra den danske Kreftforeningen (R146-A9394-16-S2). MFB og MKT ble finansiert av AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). MR og MFB var delfinansiert av Graduate School, helse, AU. E.F.W. laboratorium støttes av tilskudd fra det spanske departementet for økonomi (SAF2015-70857, delfinansiert av ERDF-EU) og en EUCLID (741888 – CSI-moro).
Vi ønsker å takke Liliana Fajardo Mellor (gener, utvikling og sykdom; National Cancer Research Center) for kritisk lesing av manuskriptet.
Materials
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
Referências
- Ferlay, J., et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012. Int J Cancer. 136, E359-E386 (2015).
- Gerlinger, M., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N Engl J Med. 366, 883-892 (2012).
- Robinson, D., et al. Integrative Clinical Genomics of Advanced Prostate Cancer. Cell. 162, 454 (2015).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214, 91-109 (2010).
- Wu, X., et al. Generation of a prostate epithelial cell-specific Cre transgenic mouse model for tissue-specific gene ablation. Mech Dev. 101, 61-69 (2001).
- Ma, X., et al. Targeted biallelic inactivation of Pten in the mouse prostate leads to prostate cancer accompanied by increased epithelial cell proliferation but not by reduced apoptosis. Cancer Res. 65, 5730-5739 (2005).
- Chen, Z., et al. Crucial role of p53-dependent cellular senescence in suppression of Pten-deficient tumorigenesis. Nature. 436, 725-730 (2005).
- Leow, C. C., Wang, X. D., Gao, W. Q. Novel method of generating prostate-specific Cre-LoxP gene switching via intraductal delivery of adenovirus. Prostate. 65, 1-9 (2005).
- Thomsen, M. K., et al. Loss of JUNB/AP-1 promotes invasive prostate cancer. Cell Death Differ. 22, 574-582 (2015).
- Cho, H., et al. a novel GEM model for metastatic prostate cancer analysis and therapy, reveals myc as a driver of Pten-mutant metastasis. Cancer Discov. 4, 318-333 (2014).
- Cho, H., et al. Rapid in vivo validation of candidate drivers derived from the PTEN-mutant prostate metastasis genome. Methods. 77-78, 197-204 (2015).
- Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159, 440-455 (2014).
- Wang, S., et al. Prostate-specific deletion of the murine Pten tumor suppressor gene leads to metastatic prostate cancer. Cancer Cell. 4, 209-221 (2003).
- Liu, W., et al. Copy number analysis indicates monoclonal origin of lethal metastatic prostate cancer. Nat Med. 15, 559-565 (2009).
- Haffner, M. C., et al. Tracking the clonal origin of lethal prostate cancer. J Clin Invest. 123, 4918-4922 (2013).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Price, D. Comparative Aspects of Development and Structure in the Prostate. Natl Cancer Inst Monogr. 12, 1-27 (1963).
- McNeal, J. E. Anatomy of the prostate: an historical survey of divergent views. Prostate. 1, 3-13 (1980).
- Thomsen, M. K., et al. SOX9 elevation in the prostate promotes proliferation and cooperates with PTEN loss to drive tumor formation. Cancer Res. 70, 979-987 (2010).
