비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

Summary

여기, 선물이 해리 했다 부동성 e10.5 췌 장 창시자와 관련된 mesenchyme 3D murine pancreatoids을 표현 하는 인슐린을 생성 하는 프로토콜.

Abstract

췌 장 혈액 포도 당 항상성 및 소화를 함께 작동 하는 많은 다른 세포 유형의 구성 하는 복잡 한 기관 이다. 이 셀 형식 효소를 은닉 포상 세포는 arborized ductal 시스템 본질적인, 그리고 호르몬 생산 하는 내 분 비 세포에 효소의 수송에 대 한 책임을 포함합니다.

내 분 비 하는 베타 세포는 낮은 혈액 포도 당 수준에 인슐린을 생성 하는 본문에 유일한 셀 유형입니다. 당뇨병, 손실 또는 베타 세포의 기능 장애를 특징으로하는 질병 전염병 비율에 도달입니다. 따라서, 파생 약물 및 세포 기반 치료제 심사 목적으로 사용할 수 있는 베타 세포 개발 조사를 프로토콜을 확립 필수적 이다. 마우스 개발의 실험 조사는 필수, vivo에서 학문은 힘들고 시간이 많이 소요. 배양된 세포 검사;에 대 한 더 편리한 플랫폼을 제공 그러나, 그들은 세포 다양성, 건축, 조직과 세포 상호 작용 발견 유지할 수 없습니다 vivo에서. 따라서, 췌 장 organogenesis 및 생리학 조사 하는 새로운 도구를 개발 하는 것이 필수적입니다.

세포 구성 하 고 복잡 한, 순수 유능한 성인 기관으로 분화 췌 장 상피 세포는 organogenesis의 발병에서 mesenchyme와 가까운 협회에서 개발. 췌 장 mesenchyme 내 분 비 개발에 대 한 많은 이해 되지 않는다 잘 아직, 따라서 생체 외에서 문화 동안 정리 하기 어려운 중요 한 신호를 제공 합니다. 여기, 우리 유지 mesenchyme, pancreatoids 라고 하는 문화 3 차원, 셀룰러 복잡 한 마우스 organoids에 프로토콜을 설명 합니다. E10.5 murine 췌 장 새싹은 해 부, 해리, 및 비 계 없는 환경에서 경작. 이러한 셀을 떠 자기 mesenchyme 개발 pancreatoid 및 내 분 비 베타 세포에는 포상 및 덕트 세포 개발의 강력한 수 포와 함께 조립. 이 시스템은 organogenesis, 또는 약물 이나 작은 분자, 유전자 검사에 대 한 세포 운명 결정, 구조, 조직과 morphogenesis, 세포-세포 상호 작용을 공부 하 사용할 수 있습니다.

Introduction

정상적인 개발 및 생리의 메커니즘을 묘사 하는 것은 질병 병 인을 이해 하 고 궁극적으로 치료 방법을 육성에 답해야 합니다. 배양 및 분화 줄기 세포 개발의 신속 하 고 높은 처리량 분석을 수 있습니다, 그것은 기존의 신체의 세포 운명 조절 메커니즘에 관한 지식에 의해 제한 됩니다 고 인위적으로 개발에이 상대적으로 균질 성, 2 차원 상태^1,2. 뿐만 아니라 vivo에서 개발 틈새와 환경에서 서로 다른 세포 유형으로 외부 영향에 의해 영향을 받는 paracrine 신호 및 조직 지원 organogenesis, 가이드를 제공 하는 있지만 이러한 세포의 기능에 의존 하 고 또한 그들의 주변 지도^3,,45. 이러한 외부 단서의 중요성, vivo에서 마우스 모델의 힘 드는 자연과 분화 프로토콜의 한계를 감안할 때, 새로운 시스템 기본 개발 프로세스 및 생리학을 실험적으로 조사 필요 합니다.

Organogenesis, 생리학, 약물 효능 및 심지어 pathogenesis. 을 편리 하 고 적합 한 시스템을 제공 하는 3 차원, 복잡 한 organoids를 생성 하는 프로토콜의 출현 대 위⁶ 과 대 장⁷ 다른 시스템 organogenesis에 대 한 우리의 이해를 확장 했다 murine organoids를 설립, 연구 개발 복잡성 vivo에서 보다 적게 제한 하는 도구를 제공 하 그리고 생체 외에서 모델입니다. Murine organoid이 진보 때문 형성과 인간 만능의 출현 줄기 세포, 인간의 장⁸, 망막⁹, 신장^10,11, 그리고 대뇌¹² organoids 생산 되어,이 레 퍼 토리만 개발 메커니즘에 관한 기존의 지식에 의해 제한 됩니다.

질병의 무수 한 재앙 다른 췌 장 세포 유형, 외 분 비 췌 장 불충분¹³,¹⁴, 췌 장 염 포상 세포에에서 포상 세포와 덕트를 포함 한 췌 장 organoids의 생성은 특별 한 관심의 고 ¹⁵당뇨병 베타 세포입니다. 이러한 서로 다른 세포 유형의 개발에 관한 지식을 얻고 고 또한, 맞춤된 약물 검사 또는 이식에 대 한 플랫폼 역할을 할 수, 있습니다. 그들의 병 리를 이해에 도움이 수 있습니다. 이전, Greggio 외. 만들 murine 췌 장 organoids morphogenesis vivo에서 정리 하 고 모든 주요 췌 장 상피 세포의 구성 하는 조직, 3 차원, 복잡 한 구조를 개발 하는 방법 개발 유형^16,17. 이것은 췌 장 분야에서 앞으로 중요 한 단계 이다, 특히 만드는 세포에 생체 외에서 베타 세포 개발의 생물 학적 조사를 설정할 수 있습니다. 그러나, 내 분 비 세포의 부족은 organoids 조직, 틈새 상호 작용 수 및 교육용 신호¹⁷제공으로 이식 했다 하지 않는 한이 프로토콜에서 형성 했다. 틈새 시장, 무 겁 게 내 분 비 박 등 차별화^{3,4, 후기에 organogenesis의 초기 단계에서 개발 상피를 뒤 덮 었의 가장 큰 부분을 구성 하는 mesenchyme 18}. 개발 췌는 mesenchyme의 상호작용은 아직 외부 신호 및 생체 내에서 세포 복잡성을 유지의 중요성 organogenesis 연구의 또 다른 예.

여기, 우리는 3 차원 췌 장 organoids, pancreatoids, 해리 e10.5 murine 췌 장 창시자에서 불리를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 pancreatoids 네이티브 mesenchyme 유지, 부동성 조건에서 자기 조립 및 내 분 비 하는 베타 세포¹⁹의 강력한 수를 포함 한 모든 주요 췌 장 세포 종류를 생성. 이 방법은 이전 프로토콜 강력한 내 분 비 차별화 부족으로 내 분 비 발달의 분석을 위해 가장 적합 하다. 그러나, 췌 장 organoids에 대 한 프로토콜을 사용 하 여 Greggio 외. 췌 장의 상피 분기 및 morphogenesis의 분석에 대 한 더 적합에 의해 설명 된 대로 분기로 더 제한 됩니다 pancreatoids.

Protocol

이 방법에 설명 된 모든 동물 실험 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 베일 러 대학의 약에 의해 승인 되었다. 1. 마우스 배아 일 10.5 췌 장 창시자의 준비 그러나 참고:이 프로토콜 않습니다 필요가 없습니다 2 단계까지 무 균 조건 하에서 지켜질 해 부 도구를 소독 하 고 사용 하기 전에 70% 에탄올 스프레이에 최적입니다. 해 부에 대 한 설정, 얼음 양?…

Representative Results

마우스 배아 자 궁 경적에서 e10.5에서의 주의 해 부 추가 해 부 (그림 1A)에 대 한 PBS에 손상 되지 않은 배아 항복 한다. 위장은 배아 (그림 1B), 내장 및 위 (그림 1C F)의 교차점에서 등 쪽 췌 장 새싹의 분별을 허용에서 효율적으로 제거할 수 있습니다. E10.5 췌 장 새싹 이?…

Discussion

셀 문화 모델의 진행은 제대로 개발 모델, 임상 관련 세포 유형, 시험 약물 효능, 또는 심지어 이식 환자에 게 중요 합니다. 그러나, 인위적으로 업과 접시에 개발은 도전으로 우리는 여전히 organogenesis과 생리학의 메커니즘을 이해 멀리 vivo에서. 따라서 체 외에서 세포는 효율적으로 생성 된, 완전히 기능, 시간, 오랜 기간 동안 유지 될 또는 본문에 대 등 한 셀에서 다른 이상 항구 수 ?…

Materials

2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes	Sigma-Aldrich	A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water	ThermoFisher	D119
Borosilicate Capillary Tubes	Sutter Instruments	GB1007515	O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate	Greiner Bio-One	650970	U-bottom
Centrifuge 5424 R	Eppendorf	5401000013
Chloroform	Sigma-Aldrich	233306
Chromogranin-A antibody	Abcam	ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60	Leica
Countess Automated Cell Counter	Invitrogen	C10310
Countess Cell Counter Slides	Invitrogen	C10312
CryoStar NX70	ThermoFisher	957000L
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride)	Roche	10 236 276 001	Powder
DBA antibody	Vector Lab	RL-1032
Dispase II, Powder	Gibco	17105041
DMEM/F-12, HEPES	Gibco	11330032
Dnase I	Invitrogen	18068-015
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-10	0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor)	Sigma-Aldrich	E9644
Ethanol, 200 Proof	Decon Laboratories	2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators	ThermoFisher	370
Fluoromount-G	Southern Biotech	OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
INSM1 Antibody	Santa Cruz BioTechnology	sc-271408	Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol	Fisher	a4164
Isothesia Isoflurane, USP	Henry Schein	11695-6776-2
Insulin Antibody	Dako	A056401	Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal	KAPA Biosystems	KK4618
KCl	KaryoMax	10575090
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal	Leica
MgCl2	Sigma-Aldrich	442615
Mouse C-Peptide ELISA	ALPCO	80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA	ALPCO	80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades	ThermoFisher	3052835
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
NaHCO3	Sigma-Aldrich	S3817
NaH2PO4	Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum	Jackson Immuno Research	017-000-121
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
PBS 1X	Corning	21-040-CV
Pdx1 antibody	DSHB	F6A11	Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds	VWR	15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution	Corning	MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate)	Sigma-Aldrich	P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	22431081	1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein	R&D Systems	345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic	Peprotech	100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein	R&D Systems	4546-RS
BenchRocker 2D	Benchmark	BR2000
Sucrose 500g	Sigma-Aldrich	S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Super Pap Pen	Electron Microscopy Sciences	71310
Thermomixer R	Eppendorf	05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
TRIzol Reagent	Invitrogen	15596018
TrypLE Express	Invitrogen	12604039	(1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain	Invitrogen	15250061	For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%)	Corning	25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%)	Gibco	25200072	Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate	Corning	3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well	Corning	4520
Vimentin Antibody	EMD Millipore	AB5733	Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie	BioExpres	S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride	R&D Systems	1254	Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope	Zeiss