Summary

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

Published: June 02, 2018
doi:

Summary

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids を表現するインスリンを生成するプロトコルを紹介します。

Abstract

膵臓は、血液グルコースの恒常性と消化を調節する一緒に働く多くの異なったセルタイプから成る複雑な器官です。これらの細胞型には酵素分泌腺房細胞、腸、およびホルモン産生の内分泌細胞に酵素の輸送を担う葉状管システムが含まれます。

内分泌のベータ細胞は、血糖値を下げるインシュリンを作り出すボディの唯一のセル タイプです。糖尿病、損失または β-細胞の障害によって特徴づけられる病気大流行に達しています。したがって、スクリーニング目的のため使用して、薬物および細胞ベースの治療を派生できます β 細胞の開発を調査するためのプロトコルを確立することが不可欠です。マウス開発の実験的調査が不可欠ですが、生体内での研究は手間と時間がかかるです。培養細胞のスクリーニング; もっと便利なプラットフォームを提供します。しかし、彼らは細胞の多様性、建築の組織、および発見した細胞間相互作用を維持することは体内。したがって、膵の形態形成と生理学を調査するための新しいツールの開発が不可欠です。

細胞を整理して複雑な生理学的に有能な大人の臓器に分化膵上皮細胞器官形成の発症から間充織と密接に関連開発します。膵間充織は、多くのよく理解されていません、まだこうして体外培養中に要約することは困難内分泌の開発のための重要な信号を提供します。ここでは、pancreatoids と呼ばれる、間充織を保持文化複雑なマウスの立体化、細胞オルガノイドするプロトコルについて述べる.E10.5 マウス膵芽は解剖、解離、足場のない環境で養殖。浮遊細胞これらは自己開発の pancreatoid と堅牢な内分泌ベータ細胞、腺房と管細胞と一緒に開発数を包み込む間充織と組み合わせてください。このシステムは、器官形成中、や薬物、小さい分子、または遺伝学的スクリーニングの細胞運命決定、構造、形態形成、細胞間の相互作用を研究するために使用できます。

Introduction

正常な発達の生理機構の輪郭を描くは、疾患の病因を理解し、最終的に治療法を育成に重要です。養殖と幹細胞の差別化により、開発を迅速かつ高スループット分析、細胞の運命を制御するメカニズムに関する知識の既存のボディによって制限されます、人工的に開発を繰り返す、比較的均質な二次元の状態1,2。だけでなく、ニッチおよび環境の異なる細胞型と外因性の影響によって影響を受ける生体の開発は器官形成を導くためパラクリン シグナルと組織的支援を提供して、これらの細胞の機能にも依存、ガイダンス3,45の周辺。これらの外部の手がかりの重要性、差別化プロトコルの制限およびマウス モデル生体内での骨の折れる性質を考えると、新しいシステムが実験的基本的な発達過程および生理学を調査するため必要です。

3次元、複雑なオルガノイドを生成するプロトコルの出現も病態. 、薬効、生理器官形成研究に便利と合同システムを提供します。6腸胃7などさまざまなシステムが器官形成の私達の理解を拡大しているためマウス オルガノイドの確立、体内よりも少ない制限で発達の複雑性を研究するためのツールを提供します。生体外モデル。形成とひと多能性の出現により幹細胞、ひと腸8、網膜9, 腎10,11, マウス organoid のこれらの進歩のためと脳12オルガノイドを生産されているとこレパートリーは、開発のメカニズムに関する既存の知識によってのみ制限されます。

特定の関心は膵オルガノイドの世代として病気の無数の膵外分泌不全13、膵炎14、腺房細胞の腺房細胞、ダクトを含む種類の異なる膵細胞を悩ませていると糖尿病15のベータ細胞。これらの異なる細胞型の開発に関する知識を得る彼らの病理を理解することに役立つ可能性が、パーソナライズされた薬剤のスクリーニングまたは移植のためのプラットフォームとして使用できます、また。Greggio生体の形態形成を要約し、すべての主要な膵上皮細胞から成る組織、立体的で複雑な構造を開発するマウスの膵オルガノイドを作成する手法を開発する以前は、16,17 を種類します。これは膵の分野で主要な前進、体外特にとして作る細胞はベータ細胞の生物学的調査を有効にできます。ただし、内分泌細胞の不足は、ニッチが対話できるし、指導手掛かり17を提供する組織に、オルガノイドを移植しない限り、このプロトコルで結成。間充織が大きく内分泌はく離と分化3,4を含む後の段階に器官形成の初期段階から開発の上皮を包み込む、ニッチの最も大きい部分を構成します。 18。発展途上膵臓と間充織相互作用はまだ器官形成を研究する外因性シグナリングと体内細胞複雑さを維持することの重要性の別の例です。

ここでは、解離の e10.5 マウス膵前駆細胞からの pancreatoids と呼ばれる三次元の膵オルガノイドを生成する方法について述べる。これらの pancreatoids ネイティブ間充織を保持、自己をフローティング状態で組み立てるし、堅牢な内分泌のベータ細胞19数など、主要な膵細胞型をすべて生成します。この方法は、以前のプロトコルは、堅牢な内分泌分化を欠いているように内分泌の開発の分析に最適です。ただし、膵オルガノイドのプロトコルを使用して Greggioは膵上皮分岐の形態形成解析に適してのとおり分岐と限定 pancreatoids。

Protocol

このメソッドに記載されているすべての動物実験は、機関動物ケアおよび使用委員会のベイラー医科大学によって承認されました。 1. マウス胚日 10.5 膵前駆細胞の調製 注: このプロトコル必要はありません手順 2 まで無菌条件の下で続くことにしかし、それは解剖ツールを殺菌し、使用する前に 70% エタノールをスプレーするが最適。 郭清を…

Representative Results

子宮角から e10.5 のマウス胚を細かくは、さらに郭清 (図 1A) の PBS で無傷の胚を得られるはず。消化管は、胚 (図 1B)、腸および胃 (図 1C F) の接続点で背側膵原基の洞察力を許可するから効率的に削除できます。E10.5 膵芽以前特徴付けされています。前駆細胞はPd…

Discussion

細胞培養モデルの進行は、適切にモデル開発、臨床的に関連する細胞の種類、試験薬の有効性、または患者にも移植を生成に不可欠です。ただし、我々 は器官形成と生理のメカニズムの理解には程遠い、挑戦は皿に開発を人工的にさた体内。こうして体外細胞が効率的に生成された、完全に機能しない、時間の長い期間のために維持されるまたは匹敵する細胞を体内からその他…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

プロトコルおよび原稿に関する有用な議論ありがとう省 Jolanta Chmielowiec。また、ベンジャミン ・ Arenkiel は共焦点顕微鏡へのアクセスに感謝我々。この作品は NIH (P30 – M.B. への DK079638) と T32HL092332-13 M.A.S. と M.B. と (M.B.) にマクネア医療財団、BCM 知的、発達障害研究センターの共焦点のコアによって支えられた (ユニスから NIH U54 HD083092ケネディ ・ シュライバー国立研究所母子保健と人間開発)。

Materials

2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes Sigma-Aldrich A5177
BarnStead NanoPure Nuclease-free water ThermoFisher D119
Borosilicate Capillary Tubes Sutter Instruments GB1007515 O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length
CaCl2 Sigma-Aldrich C5080
Cell-Repellent 96-Well Microplate Greiner Bio-One 650970 U-bottom
Centrifuge 5424 R Eppendorf 5401000013
Chloroform Sigma-Aldrich 233306
Chromogranin-A antibody Abcam ab15160
Compact, Modular Stereo Microscope M60 Leica
Countess Automated Cell Counter Invitrogen C10310
Countess Cell Counter Slides Invitrogen C10312
CryoStar NX70 ThermoFisher 957000L
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G7528
DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) Roche 10 236 276 001 Powder
DBA antibody Vector Lab RL-1032
Dispase II, Powder Gibco 17105041
DMEM/F-12, HEPES Gibco 11330032
Dnase I Invitrogen 18068-015
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-10 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip
EGF (Epidermal growth factor) Sigma-Aldrich E9644
Ethanol, 200 Proof Decon Laboratories 2716
Forma Steri Cycle CO2 Incubators ThermoFisher 370
Fluoromount-G Southern Biotech OB10001
Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa Sigma-Aldrich H3149-10KU
INSM1 Antibody Santa Cruz BioTechnology sc-271408 Polyclonal Mouse IgG
Isopropanol Fisher a4164
Isothesia Isoflurane, USP Henry Schein 11695-6776-2
Insulin Antibody Dako A056401 Polyclonal Guinea Pig
KAPA SYBR FAST Universal KAPA Biosystems KK4618
KCl KaryoMax 10575090
KnockOut Serum Replacement Invitrogen 10828028
Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal Leica
MgCl2 Sigma-Aldrich 442615
Mouse C-Peptide ELISA ALPCO 80-CPTMS-E01
Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA ALPCO 80-INSMSU-E01
MX35 Microtome Blades ThermoFisher 3052835
NaCl Sigma-Aldrich S7653
NaHCO3 Sigma-Aldrich S3817
NaH2PO4 Sigma-Aldrich
Normal Donkey Serum Jackson Immuno Research 017-000-121
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
PBS 1X Corning 21-040-CV
Pdx1 antibody DSHB F6A11 Monoclonal Mouse MIgG1
Peel-A-Way Disposable Embedding Molds VWR 15160-157
Penicillin-Streptomycin Solution Corning MT30002CI
PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) Sigma-Aldrich P1585
Protein LoBind Microcentrifuge Tubes Eppendorf 22431081 1.5mL Capacity
Recombinant Human FGF-10 Protein R&D Systems 345-FG
Recombinant Human FGF-Acidic Peprotech 100-17A
Recombinant Human R-Spondin I Protein R&D Systems 4546-RS
BenchRocker 2D Benchmark BR2000
Sucrose 500g Sigma-Aldrich S0389
SuperFrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
Super Pap Pen Electron Microscopy Sciences 71310
Thermomixer R Eppendorf 05-412-401
Tissue Tek O.C.T. Compound Sakura 4583
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
TRIzol Reagent Invitrogen 15596018
TrypLE Express Invitrogen 12604039 (1x), no Phenol Red
Trypan Blue Stain Invitrogen 15250061 For cell counting slides
Trypsin-EDTA (0.05%) Corning 25-052-CI
Trypsin-EDTA (0.25%) Gibco 25200072 Phenol Red
Ultra-Low Attachment 24-Well Plate Corning 3473
Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well Corning 4520
Vimentin Antibody EMD Millipore AB5733 Polyclonal Chicken IgY
Vortex Genie BioExpres S-7350-1
Y-27632 Dihydrochloride R&D Systems 1254 Also known as ROCK inhibitor
Zeiss 710 Confocal Microscope Zeiss

Referências

  1. Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  2. Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
  3. Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
  4. Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
  5. Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
  6. Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
  9. Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
  10. Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
  11. Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
  12. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  13. Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
  14. Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
  15. Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
  16. Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
  17. Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
  18. Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
  19. Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
  20. Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
  21. Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
  22. Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
  23. Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
  24. Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
  25. Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
  26. Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
  27. Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurociência. 49 (3), 497-528 (1992).
  28. Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
  29. Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
  30. Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
  31. Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
  32. Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Scavuzzo, M. A., Teaw, J., Yang, D., Borowiak, M. Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro. J. Vis. Exp. (136), e57599, doi:10.3791/57599 (2018).

View Video