Поколение эшафот бесплатно, трехмерные инсулина выражая Pancreatoids от мыши поджелудочной железы прародителями в пробирке
Summary
Здесь мы представляем протокол для создания инсулина, выражая 3D мышиных pancreatoids от свободного плавания e10.5 отделить поджелудочной железы прародителями и связанные мезенхимы.
Abstract
Поджелудочная железа является сложный орган, состоящий из многих различных типов клеток которые работают вместе, чтобы регулировать гомеостаз глюкозы крови и пищеварение. Эти типы клеток включают фермента секретирующих железистый клетки, arborized протоковой системы, отвечают за транспортировку ферментов, кишки и производство гормонов эндокринных клеток.
Эндокринных бета клетки являются единственной ячейки тип в теле, которые производят инсулин, чтобы снизить уровень глюкозы в крови. Диабет, заболевание, характеризующееся потерей или дисфункции бета клеток, достигает масштабов эпидемии. Таким образом важно разработать протоколы для расследования развития бета клеток, который может использоваться для целей отбора для получения наркотиков и на основе ячеек терапии. В то время как экспериментальное исследование мыши развития имеет важное значение, в vivo исследования являются трудоемким и длительным. Культивируемых клеток обеспечивают более удобную площадку для скрининга; Однако, они не в состоянии поддерживать сотовой разнообразия, архитектурные организации и клеточных взаимодействия нашли в vivo. Таким образом крайне важно разработать новые инструменты для изучения физиологии и поджелудочной железы органогенеза.
Эпителиальных клеток поджелудочной железы развивать в тесной связи с Мезенхима с самого начала органогенеза как клетки организовать и дифференцироваться в сложных, физиологически компетентный орган, взрослых. Поджелудочной железы Мезенхима обеспечивает важные сигналы для эндокринной развития, многие из которых не вполне понятны, таким образом трудно резюмировать во время культуры в пробирке . Здесь мы описываем протокол к organoids трехмерную, сотовые комплекс мыши культуры, которые сохраняют мезенхимы, называется pancreatoids. E10.5 мышиных поджелудочной железы бутон расчлененный, отделить и культивировали в среде леса бесплатно. Эти плавающие клетки самостоятельно собрать с мезенхимы, обволакивающий развивающихся pancreatoid и надежный количество эндокринной бета клеток, развивающихся вместе с железистый и проток клетки. Эта система может использоваться для изучения взаимодействия клеток определение судьбы, структурной организации и морфогенеза, ячеек во время органогенез, или наркотиков, малые молекулы, или генетического скрининга.
Introduction
Определяющие механизмы нормального развития и физиологии имеет первостепенное значение для понимания этиологии заболевания и в конечном счете культивировать методов лечения. В то время как культивирование и дифференциации стволовых клеток позволяет быстро и высок объём анализ развития, он ограничивается существующего свода знаний о механизмах, регулирующих клеток судьба и искусственно резюмирует развития в относительно однородная, двумерные состояние1,2. Не только в естественных условиях развития пострадавших от внешних влияний, с различных типов клеток в нишу и окружение оказывает паракринными сигналов и организационной поддержки для руководства органогенез, но функция этих клеток также опирается на их окружение для руководства3,4,5. Учитывая важность этих внешних сигналов, ограничения протоколов дифференциации и трудоемкий характер в vivo моделей мышей, новых систем необходимы для экспериментально изучения основных процессов развития и физиологии.
Появление протоколов для создания трехмерных, сложных organoids обеспечивает удобный и конгруэнтных системы к изучению органогенеза, физиологии, эффективность препарата и даже патогенеза. Создание мышиных organoids для различных систем, таких как желудок6 и кишечника7 расширили наше понимание органогенез, обеспечивая инструмент для изучения развития сложностей с меньше ограничений, чем в естественных условиях и в пробирке модели. За эти достижения в мышиных органоид формирования и появлением человеческих плюрипотентных стволовых клеток человека кишечные8, сетчатки9, почечной10,11, и мозгового12 organoids были произведены и это репертуар ограничивается только существующих знаний относительно механизмов развития.
Особый интерес это поколение organoids поджелудочной железы, как множество заболеваний страдает различных поджелудочной железы типов клеток, включая железистый клетки и протоки поджелудочной экзокринной недостаточности13, железистый клетки в панкреатита14, и бета-клетки в диабет15. Получение знаний о разработке этих различных типов клеток может помочь в понимании их патологии и может Кроме того, выступать в качестве платформы для персональной наркотиков скрининг или трансплантации. Ранее Greggio et al. разработали метод для создания мышиных поджелудочной железы organoids пилки в vivo морфогенеза и развивать организованной, трехмерные, сложные структуры, состоящий из всех основных эпителиальных клеток поджелудочной железы типы16,17. Это является крупным шагом вперед в области поджелудочной железы, особенно делая клетки в пробирке может позволить биологические исследования развития бета клеток. Однако нехватка эндокринных клеток формируется в этом протоколе если organoids были пересажены в ткани, где нишу могли взаимодействовать и предоставляют учебные подсказки17. Мезенхима представляет собой наибольшую часть ниши, сильно обертывающей развивающихся эпителия от ранних стадиях органогенеза на более поздних этапах, включая эндокринной расслаивания и дифференциации3,4, 18. Взаимодействие между Мезенхима развивающихся поджелудочной железы является еще одним примером внешней сигнализации и важность сохранения в vivo сотовой сложности для изучения органогенеза.
Здесь мы опишем, как для создания трехмерных поджелудочной железы organoids, называют pancreatoids, от диссоциированных e10.5 мышиных поджелудочной железы прародителями. Эти pancreatoids сохранить родной мезенхимы, самостоятельно собрать в условиях свободного плавания и создать все типы основных клеток поджелудочной железы, включая надежные количество эндокринной бета-клетки19. Этот подход лучше всего подходит для анализа развития эндокринной, как предыдущие протоколы отсутствуют надежные эндокринной дифференциации. Однако используя протокол для поджелудочной железы organoids как описано в Greggio, et al. лучше подходит для анализа поджелудочной железы эпителиальных ветвления и морфогенеза, как ветвление более ограничен в pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
Прогрессирование клетки культуры моделей имеет решающее значение для правильной модели развития, производят типы клинически значимых клеток, эффективность препарата испытания или даже трансплантации пациентам. Однако, искусственно изложив развития в блюдо сложной, как мы все еще да?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Jolanta Chmielowiec за полезной дискуссии относительно протокола и рукописи. Мы также благодарим Бенджамин Arenkiel для доступа к конфокального микроскопа. Эта работа была поддержана NIH (P30-DK079638 к м.б.) и T32HL092332-13 M.A.S. и м.б., Макнэйр медицинского фонда (м.б.) и конфокальный ядро на BCM интеллектуальной и отклонениями в развитии научно-исследовательский центр (низ U54 HD083092 от Юнис Кеннеди Шрайвер Национальный Институт детского здоровья и развития человеческого потенциала).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referências
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurociência. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
