Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att generera insulin uttrycker 3D murina pancreatoids från friflytande e10.5 dissocierade bukspottskörteln stamfäder och den associerade mesenchyme.
Abstract
Bukspottkörteln är ett komplext organ sammansatt av många olika celltyper som samverkar för att reglera blod glukos homeostas och matsmältningen. Dessa celltyper inkluderar enzym-utsöndrar acinar celler, en arborized duktal system som ansvarar för transport av enzymer i tarmen och hormonproducerande endokrina celler.
Endokrina betacellerna är den enda Celltypen i kroppen som producerar insulin att sänka blodsockernivåerna. Diabetes, en sjukdom som kännetecknas av en förlust eller dysfunktion av beta-celler, är att nå epidemiska proportioner. Därför är det nödvändigt att upprätta protokoll för att undersöka beta-cell utveckling som kan användas vid screening för att härleda den drog- och cellbaserade therapeutics. Medan den experimentella undersökningen av mus utveckling är nödvändigt, är in-vivo studier mödosam och tidskrävande. Odlade celler ger en bekvämare plattform för screening; de är dock inte behålla den cellulära mångfald, arkitektoniska organisation och cellulära interaktioner hittade invivo. Därför är det viktigt att utveckla nya verktyg för att undersöka pankreas organogenes och fysiologi.
Bukspottskörteln epitelceller utvecklas i nära association med mesenchyme från uppkomsten av organogenes som cellerna organisera och differentieras till komplexa, fysiologiskt behöriga vuxna organ. Den pankreas mesenchyme ger viktiga signaler för endokrina utveckling, varav många inte är förstått ännu, således svårt att sammanfatta under in vitro- kulturen. Här beskriver vi ett protokoll till kultur tredimensionella, cellulär komplex musen organoids att behåller mesenchyme, kallas pancreatoids. E10.5 murina bukspottskörteln knoppen är dissekeras, separerade och odlade i en byggnadsställning-fri miljö. Dessa flytande celler montera själv med mesenchyme omsluter den framkallande pancreatoid och en robust antalet endokrina betacellerna utveckla tillsammans med den acinar och kanal celler. Detta system kan användas för att studera cell öde bestämning, strukturella organisationen och morfogenes, cell-cell interaktioner under organogenesen eller för läkemedel, liten molekyl eller genetisk screening.
Introduction
Avgränsar mekanismer normala utveckling och fysiologi är av största vikt att förstå sjukdomen etiologi och slutligen odla behandlingsmetoder. Medan odling och differentiera stamceller möjliggör snabb och hög genomströmning analys av utveckling, det begränsas av befintliga kroppen av kunskap om mekanismer som reglerar cell öde och artificiellt recapitulates utveckling i en relativt homogen, tvådimensionell stat1,2. Inte bara i vivo utveckling påverkas av yttre påverkan, med olika celltyper i nisch och miljö tillhandahåller parakrin signaler och organisatoriskt stöd för att vägleda organogenes, men funktionen av dessa celler också beroende av deras omgivningen för vägledning3,4,5. Med tanke på betydelsen av dessa externa ledtrådar, begränsning av differentiering protokoll, och mödosamma beskaffenhet i vivo musmodeller, behövs nya system för att undersöka grundläggande utvecklingsprocesser och fysiologi.
Uppkomsten av protokollen att generera tredimensionella, komplexa organoids ger ett bekvämt och kongruent system för att studera organogenes, fysiologi, drogen effekt och även patogenes. Inrättande av murina organoids för olika system såsom den mage6 och tarmen7 har utökat vår förståelse för organogenes, ger ett verktyg för att studera utvecklingsmässiga komplexiteten med färre restriktioner än i vivo och in vitro- modeller. På grund av dessa framsteg i det murina organoid bildandet och tillkomsten av mänskliga pluripotenta stamceller celler, human intestinal8, retinal9, nedsatt10,11, och cerebral12 organoids har producerats, och detta repertoaren är endast begränsad av den befintliga kunskapen om mekanismerna för utveckling.
Av särskilt intresse är generationen av bukspottskörteln organoids, som en myriad av sjukdomar plågar olika bukspottskörteln celltyper, däribland acinar celler och kanaler i exokrin pankreasinsufficiens13, acinar celler i pankreatit14, och beta-cellerna i diabetes15. Få kunskap om utvecklingen av dessa olika celltyper kan stöd för att förstå deras patologi och kan också fungera som en plattform för personlig drogkontroll eller transplantation. Tidigare, Greggio et al. utvecklat en metod att skapa murina bukspottskörteln organoids som recapitulate i vivo morfogenes och utveckla organiserad, tredimensionella, komplexa strukturer består av alla större bukspottskörteln epitelceller typer16,17. Detta är ett stort steg framåt i fältet bukspottskörteln, särskilt som gör celler in vitro- kan aktivera biologisk undersökning av beta-cell utveckling. Dock en brist på endokrina celler bildas i detta protokoll såvida organoids transplanterades in i vävnaden, där nischen kunde interagera och ge instruktions cues17. Mesenchyme utgör den största delen av den nisch, tungt kuvertering utveckla epitel från tidiga organogenesen till senare stadier inklusive endokrina delaminering och differentiering3,4, 18. Samspelet mellan mesenchyme med utveckla bukspottkörteln är ännu ett exempel av yttre signalering och vikten av att upprätthålla i vivo cellulära komplexitet att studera organogenes.
Här, beskriver vi hur man skapar tredimensionella bukspottskörteln organoids, kallas pancreatoids, från dissocierade e10.5 murina bukspottskörteln stamfäder. Dessa pancreatoids behålla infödda mesenchyme själv montera i friflytande villkor och generera alla stora bukspottskörteln celltyper, däribland en robust antal endokrina betacellerna19. Detta tillvägagångssätt är bäst lämpad för analys av endokrina utveckling, eftersom tidigare protokoll saknar robust endokrin differentiering. Dock använder protokollet för bukspottskörteln organoids som beskrivs av Greggio et al. är bättre lämpad för analys av bukspottskörteln epitelial förgrening och morfogenes, som förgrening är mer begränsade i pancreatoids.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av cellen kultur modeller är avgörande för korrekt modell utveckling, ge kliniskt relevanta celltyper, test drogen effekt eller ens transplantation till patienter. Dock går konstgjort igenom utveckling i en maträtt är utmanande eftersom vi är fortfarande långt ifrån förstå mekanismerna för organogenes och fysiologi invivo. In vitro- celler är således ineffektivt genererade, inte fullt fungerande, inte kan bibehållas under lång tid eller hysa andra avvikelser från jämförba…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Jolanta Chmielowiec för bra diskussion angående protokollet och manuskript. Vi tackar också Benjamin Arenkiel för tillgång till confocal mikroskopet. Detta arbete fick stöd av NIH (P30-DK079638 till M.B.) och T32HL092332-13 M.A.S. och M.B., McNair medicinska stiftelsen (att M.B.) och confocal kärnan vid BCM intellektuella och utvecklingsstörningar Research Center (NIH U54 HD083092 från Eunice Kennedy Shriver nationella institutet för barns hälsa och mänskliga utvecklingen).
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Aspirator Tube Assemblies for Calibrated Microcapillary Pipettes | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| BarnStead NanoPure Nuclease-free water | ThermoFisher | D119 | |
| Borosilicate Capillary Tubes | Sutter Instruments | GB1007515 | O.D. 1mm, I.D. 0.75mm, 1.5cm length |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5080 | |
| Cell-Repellent 96-Well Microplate | Greiner Bio-One | 650970 | U-bottom |
| Centrifuge 5424 R | Eppendorf | 5401000013 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 233306 | |
| Chromogranin-A antibody | Abcam | ab15160 | |
| Compact, Modular Stereo Microscope M60 | Leica | ||
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10310 | |
| Countess Cell Counter Slides | Invitrogen | C10312 | |
| CryoStar NX70 | ThermoFisher | 957000L | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| DAPI (4',6-Diamidine-2'-phenylindole-dihydrochloride) | Roche | 10 236 276 001 | Powder |
| DBA antibody | Vector Lab | RL-1032 | |
| Dispase II, Powder | Gibco | 17105041 | |
| DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 11330032 | |
| Dnase I | Invitrogen | 18068-015 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | 0.05 x 0.02 mm; Titanium; Biology tip |
| EGF (Epidermal growth factor) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ethanol, 200 Proof | Decon Laboratories | 2716 | |
| Forma Steri Cycle CO2 Incubators | ThermoFisher | 370 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | OB10001 | |
| Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| INSM1 Antibody | Santa Cruz BioTechnology | sc-271408 | Polyclonal Mouse IgG |
| Isopropanol | Fisher | a4164 | |
| Isothesia Isoflurane, USP | Henry Schein | 11695-6776-2 | |
| Insulin Antibody | Dako | A056401 | Polyclonal Guinea Pig |
| KAPA SYBR FAST Universal | KAPA Biosystems | KK4618 | |
| KCl | KaryoMax | 10575090 | |
| KnockOut Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| Leica TCS SPE High-Resolution Spectral Confocal | Leica | ||
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 442615 | |
| Mouse C-Peptide ELISA | ALPCO | 80-CPTMS-E01 | |
| Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA | ALPCO | 80-INSMSU-E01 | |
| MX35 Microtome Blades | ThermoFisher | 3052835 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S3817 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | ||
| Normal Donkey Serum | Jackson Immuno Research | 017-000-121 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Pdx1 antibody | DSHB | F6A11 | Monoclonal Mouse MIgG1 |
| Peel-A-Way Disposable Embedding Molds | VWR | 15160-157 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution | Corning | MT30002CI | |
| PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Protein LoBind Microcentrifuge Tubes | Eppendorf | 22431081 | 1.5mL Capacity |
| Recombinant Human FGF-10 Protein | R&D Systems | 345-FG | |
| Recombinant Human FGF-Acidic | Peprotech | 100-17A | |
| Recombinant Human R-Spondin I Protein | R&D Systems | 4546-RS | |
| BenchRocker 2D | Benchmark | BR2000 | |
| Sucrose 500g | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| SuperFrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Super Pap Pen | Electron Microscopy Sciences | 71310 | |
| Thermomixer R | Eppendorf | 05-412-401 | |
| Tissue Tek O.C.T. Compound | Sakura | 4583 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604039 | (1x), no Phenol Red |
| Trypan Blue Stain | Invitrogen | 15250061 | For cell counting slides |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Corning | 25-052-CI | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200072 | Phenol Red |
| Ultra-Low Attachment 24-Well Plate | Corning | 3473 | |
| Ultra-Low Attachment Spheroid Plate 96-Well | Corning | 4520 | |
| Vimentin Antibody | EMD Millipore | AB5733 | Polyclonal Chicken IgY |
| Vortex Genie | BioExpres | S-7350-1 | |
| Y-27632 Dihydrochloride | R&D Systems | 1254 | Also known as ROCK inhibitor |
| Zeiss 710 Confocal Microscope | Zeiss |
Referências
- Clevers, H. Modeling Development and Disease with Organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Akkerman, N., Defize, L. H. Dawn of the organoid era: 3D tissue and organ cultures revolutionize the study of development, disease, and regeneration. Bioessays. 39 (4), (2017).
- Guo, T., Landsman, L., Li, N., Hebrok, M. Factors expressed by murine embryonic pancreatic mesenchyme enhance generation of insulin-producing cells from hESCs. Diabetes. 62 (5), 1581-1592 (2013).
- Landsman, L., et al. Pancreatic mesenchyme regulates epithelial organogenesis throughout development. PLoS Biology. 9 (9), 1001143 (2011).
- Lammert, E., Cleaver, O., Melton, D. Induction of pancreatic differentiation by signals from blood vessels. Science. 294 (5542), 564-567 (2001).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Spence, J. R., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro. Nature. 470 (7332), 105-109 (2011).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Xia, Y., et al. The generation of kidney organoids by differentiation of human pluripotent cells to ureteric bud progenitor-like cells. Nature Protocols. 9 (11), 2693-2704 (2014).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Loftus, S. K., et al. Acinar cell apoptosis in Serpini2-deficient mice models pancreatic insufficiency. PLoS Genetics. 1 (3), 38 (2005).
- Kleeff, J., et al. Chronic pancreatitis. Nat Rev Dis Primers. 3, 17060 (2017).
- Murtaugh, L. C., Melton, D. A. Genes, signals, and lineages in pancreas development. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 19, 71-89 (2003).
- Greggio, C., De Franceschi, F., Figueiredo-Larsen, M., Grapin-Botton, A. In vitro pancreas organogenesis from dispersed mouse embryonic progenitors. Journal of Visualized Experiments. (89), 51725 (2014).
- Greggio, C., et al. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development. 140 (21), 4452-4462 (2013).
- Sneddon, J. B., Borowiak, M., Melton, D. A. Self-renewal of embryonic-stem-cell-derived progenitors by organ-matched mesenchyme. Nature. 491 (7426), 765-768 (2012).
- Scavuzzo, M. A., Yang, D., Borowiak, M. Organotypic pancreatoids with native mesenchyme develop Insulin producing endocrine cells. Scientific Reports. 7 (1), 10810 (2017).
- Murtaugh, L. C., Stanger, B. Z., Kwan, K. M., Melton, D. A. Notch signaling controls multiple steps of pancreatic differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (25), 14920-14925 (2003).
- Nelson, S. B., Schaffer, A. E., Sander, M. The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells. Development. 134 (13), 2491-2500 (2007).
- Seymour, P. A., et al. SOX9 is required for maintenance of the pancreatic progenitor cell pool. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (6), 1865-1870 (2007).
- Kawaguchi, Y., et al. The role of the transcriptional regulator Ptf1a in converting intestinal to pancreatic progenitors. Nature Genetics. 32 (1), 128-134 (2002).
- Hara, M., et al. Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).
- Holthofer, H., Schulte, B. A., Spicer, S. S. Expression of binding sites for Dolichos biflorus agglutinin at the apical aspect of collecting duct cells in rat kidney. Cell and Tissue Research. 249 (3), 481-485 (1987).
- Reichert, M., et al. Isolation, culture and genetic manipulation of mouse pancreatic ductal cells. Nature Protocols. 8 (7), 1354-1365 (2013).
- Winkler, H., Fischer-Colbrie, R. The chromogranins A and B: the first 25 years and future perspectives. Neurociência. 49 (3), 497-528 (1992).
- Burcelin, R., Knauf, C., Cani, P. D. Pancreatic alpha-cell dysfunction in diabetes. Diabetes and Metabolism. 34, 49-55 (2008).
- Del Prato, S., Marchetti, P. Beta- and alpha-cell dysfunction in type 2 diabetes. Hormone and Metabolic Research. 36 (11-12), 775-781 (2004).
- Piciucchi, M., et al. Exocrine pancreatic insufficiency in diabetic patients: prevalence, mechanisms, and treatment. International Journal of Endocrinology. 2015, 595649 (2015).
- Campbell-Thompson, M., Rodriguez-Calvo, T., Battaglia, M. Abnormalities of the Exocrine Pancreas in Type 1 Diabetes. Current Diabetes Reports. 15 (10), 79 (2015).
- Shivaprasad, C., Pulikkal, A. A., Kumar, K. M. Pancreatic exocrine insufficiency in type 1 and type 2 diabetics of Indian origin. Pancreatology. 15 (6), 616-619 (2015).
