मल्टीप्लेक्स Genotyping और जनसंचार स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ नैदानिक पलटन अध्ययन में उंमीदवार जीन परीक्षण
Summary
जटिल मानव रोग के लिए योगदान आनुवंशिक वेरिएंट की पहचान हमें उपंयास तंत्र की पहचान करने के लिए अनुमति देता है । यहां, हम उंमीदवार जीन या जीन मार्ग विश्लेषण के लिए एक मल्टीप्लेक्स genotyping दृष्टिकोण है कि कम कीमत पर कवरेज अधिकतम और पलटने के लिए उत्तरदाई है आधारित अध्ययन का प्रदर्शन ।
Abstract
जटिल रोगों अक्सर कई आम आनुवंशिक वेरिएंट है कि रोग संवेदनशीलता में योगदान द्वारा टिकी हैं । यहां, हम मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख का उपयोग कर एक लागत प्रभावी टैग एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपता (SNP) दृष्टिकोण का वर्णन, नैदानिक साथियों में जीन मार्ग संघों की जांच करने के लिए । हम एक उदाहरण के रूप में खाद्य एलर्जी उंमीदवार लोकस Interleukin13 (IL13) की जांच । यह विधि एक क्षेत्र के भीतर साझा संपर्क संतुलन (LD) का लाभ लेने के द्वारा कवरेज को कुशलतापूर्वक अधिकतम कर लेती है । चयनित LD SNPs तो एक मल्टीप्लेक्सित परख में डिजाइन किए हैं, ४० अलग SNPs को सक्षम करने के लिए एक साथ विश्लेषण किया जाएगा, लागत प्रभावशीलता बढ़ाने । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) लक्ष्य loci बढ़ाना, एकल न्यूक्लियोटाइड विस्तार के बाद किया जाता है, और amplicons तो मैट्रिक्स का उपयोग कर मापा जाता है-असिस्टेड लेजर desorption/ionization-उड़ान के समय (मालदी-तोफ) मास स्पेक्ट्रोमेट्री । कच्चे उत्पादन जीनोटाइप कॉलिंग सॉफ्टवेयर के साथ विश्लेषण किया है, कड़े गुणवत्ता नियंत्रण परिभाषा और कट-नापसंद का उपयोग कर, और उच्च संभाव्यता पादी निर्धारित कर रहे है और डेटा विश्लेषण के लिए उत्पादन ।
Introduction
मानव जटिल रोग में, आनुवंशिक वेरिएंट रोग संवेदनशीलता के लिए योगदान और इन वेरिएंट रोगजनन समझने के लिए उपयोगी हो सकता है, उच्च जोखिम रोगी समूहों की पहचान, और उपचार प्रतिक्रियाएँ. दरअसल, परिशुद्धता दवा का वादा रोगी उपसमूह1की पहचान करने के लिए जीनोमिक जानकारी का उपयोग करने पर निर्भर है । दुर्भाग्य से, जटिल रोग जीवविज्ञान अंतरिक्ष के भीतर, जहां रोग phenotypes पर्याप्त आनुवंशिक विविधता, कम penetrance, और चर expressivity द्वारा टिकी हैं, के जीनोम के लिए आकार आवश्यकताओं-व्यापक दृष्टिकोण उपंयास की पहचान करने के लिए प्रत्याशी अक्सर बड़े2नकारात्मक स्तर तक हैं । वैकल्पिक रूप से, एक लक्षित उंमीदवार जीन दृष्टिकोण विशिष्ट जीन के बारे में एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के साथ शुरू होता है/ मार्ग विश्लेषण उपकरण सामांयतः एक पहचान लक्ष्य loci के pathophysiology की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है, कई उंमीदवार रास्ते पैदा करने के लिए पता लगाया जाएगा । हम यहां एक मल्टीप्लेक्स genotyping एक परख के साथ SNPs के सैकड़ों के लिए दसियों की जांच के लिए अनुमति दृष्टिकोण, मानव पलटन4अध्ययन के लिए उपयुक्त प्रदर्शन । इस दृष्टिकोण के माध्यम से अपेक्षाकृत उच्च रखा है, डीएनए नमूनों के हजारों के लिए सैकड़ों की अनुमति उपंयास खोज अध्ययन और विशिष्ट रास्ते की जांच के लिए genotyped हो । यहां उल्लिखित विधियों में एक अपेक्षाकृत तेजी से और सस्ती तरीके से नैदानिक लक्षण के साथ जोखिम alleles और उनके संघों की पहचान करने के लिए उपयोगी होते हैं । इस मंच को स्क्रीनिंग और नैदानिक प्रयोजनों के लिए किया गया है अत्यधिक लाभप्रद5,6, और अधिक हाल ही में, माइक्रोबियल संक्रमण के लिए7 और मानव papillomavirus8।
इस प्रोटोकॉल जांच के लिए जीन का एक सेट के चयन के साथ शुरू होता है, अर्थात्, लक्षित क्षेत्रों, आमतौर पर खोज साहित्य, या रोग की प्रक्रिया में शामिल होने के लिए एक प्राथमिकताओं परिकल्पना के माध्यम से निर्धारित; या शायद एक डिस्कवरी जीनोम चौड़ा एसोसिएशन (GWA) के अध्ययन के अग्रणी संघों के रूप में प्रतिकृति के लिए चुना है । जीन सेट से शोधकर्ता टैग SNPs की एक परिष्कृत सूची का चयन करेंगे । अर्थात, लिंकेज संतुलन (LD), या सहसंबंध, क्षेत्र में भिन्न प्रकार के बीच में एक प्रतिनिधि ‘ टैग SNP ‘ SNPs के एक समूह के लिए उच्च LD, एक haplotype के रूप में जाना जाता है की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है । इस क्षेत्र के उच्च LD का मतलब है कि SNPs अक्सर एक साथ इस तरह विरासत में मिला है कि genotyping एक SNP सभी SNPs में haplotype में भिंनता का प्रतिनिधित्व करने के लिए पर्याप्त है । वैकल्पिक रूप से, यदि कई क्षेत्रों से SNPs की एक निश्चित सूची पर निंनलिखित, उदाहरणके लिए, एक GWA अध्ययन के लिए प्रतिकृति, इस प्रक्रिया को अनावश्यक हो सकता है । के लिए मल्टीप्लेक्स genotyping, एक परख तो इन लक्ष्यों के आसपास डिजाइन किया जाना चाहिए ऐसी है कि प्रवर्धन प्राइमर विस्तार प्राइमरों और उत्पादों के लिए व्याख्यात्मक मास स्पेक्ट्रा उत्पादन के उन लोगों के लिए जन भिंन के हैं । इन मापदंडों को आसानी से एक मल्टीप्लेक्स genotyping परख डिजाइन उपकरण द्वारा कार्यांवित कर रहे हैं । इस डिजाइन से आगे और रिवर्स प्राइमरों के लिए ब्याज के मार्कर लक्ष्य और SNP युक्त अनुक्रम बढ़ाना इस्तेमाल किया जाएगा । विस्तार प्राइमरों सीधे SNPs और एक एकल, जन संशोधित, ‘ टर्मिनेटर ‘ आधार है कि SNP के पूरक है संलग्न जोड़ दिया जाता है । टर्मिनेटर बेस डीएनए के आगे विस्तार को रोकता है । जन-आधार के संशोधन के एक एकल आधार से भिंन टुकड़ों में सक्षम बनाता है जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाया जाएगा । genotyping रसायन युक्त थाली तो एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री मंच पर माप के लिए एक चिप के लिए लागू किया जाता है । कच्चे genotyping कॉल प्रणाली द्वारा पता चला उचित गुणवत्ता नियंत्रण लागू करने के बाद, डेटा और निर्यात किया जा सकता है सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए इस्तेमाल के लिए रोग phenotypes के साथ सहयोग के लिए परीक्षण ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मल्टीप्लेक्स genotyping की विधि का प्रदर्शन करते हैं । प्रतिनिधि परिणाम मालदी के साथ युग्मित पीसीआर का उपयोग कर उत्पंन किया गया-तोफ सामग्री की तालिक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को कोई पावती नहीं है ।
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
References
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