Gène candidat essais dans des études de cohortes cliniques avec génotypage multiplexé et spectrométrie de masse
Summary
Identification des variantes génétiques qui contribuent à la maladie humaine complexe permet de repérer les nouveaux mécanismes. Ici, nous démontrons une approche de génotypage multiplex de gènes candidats ou analyse de voie de gène qui maximise la protection à faible coût et peut faire l’objet d’études de cohorte.
Abstract
Maladies complexes reposent souvent sur plusieurs variants génétiques communs qui contribuent à la susceptibilité à la maladie. Nous décrivons ici une approche de polymorphisme (SNP) de nucléotide simple tag rentable en utilisant un test de génotypage multiplexée avec la spectrométrie de masse, à étudier les associations de voie de gène dans les cohortes de la cliniques. A titre d’exemple, nous étudions le locus de candidat d’allergie alimentaire Interleukin13 (IL13). Cette méthode optimise efficacement la couverture en profitant de déséquilibre de liaison partagée (LD) au sein d’une région. SNP sélectionnés de LD puis visent dans un essai multiplexé, permettant jusqu’à 40 différents SNP à analyser en même temps, augmenter la rentabilité. Réaction en chaîne par polymérase (PCR) est utilisée pour amplifier les loci de cible, suivis de nucléotide simple extension, et les amplicons sont alors mesurés à l’aide de laser assistée par matrice désorption/ionisation-temps flight(MALDI-TOF) de spectrométrie de masse. La sortie brute est analysée avec le génotype composant logiciel, en utilisant le contrôle de la qualité rigoureuses définitions et seuils, et les génotypes de forte probabilité sont déterminés et d’analyse des données de sortie.
Introduction
Dans la maladie humaine complexe, variants génétiques contribuent à la susceptibilité à la maladie et quantifier ces variantes peut-être être utile pour la pathogénie de compréhension, identifier les groupes patients à risque élevé et les intervenants de traitement. En effet, la promesse de la médecine de précision est dépendante de l’utilisation de l’information génomique pour identifier des sous-groupes de patients1. Malheureusement, en l’espace de biologie des maladies complexes, où les phénotypes de la maladie sont sous-tendus par une hétérogénéité génétique importante, faible pénétrance et expressivité variable, cohorte taille les besoins pour les approches de Génome-large d’identifier roman les candidats sont souvent excessivement large2. Par ailleurs, une approche de gène candidat ciblé commence par une hypothèse a priori sur les gènes spécifiques et des sentiers dans l’ étiologie de la maladie3. Outils d’analyse de parcours sont utilisées pour étudier la physiopathologie d’un locus de cibles identifiés, générant de nombreuses voies de candidat d’être explorées. Nous montrons ici une approche de génotypage multiplex permettant l’étude des dizaines ou des centaines de SNP avec un dosage, adaptés aux études de cohorte humaine4. Cette approche est relativement élevée à travers-mis, permettant à des centaines de milliers d’échantillons d’ADN d’être génotypés pour les études de la découverte et l’étude des voies spécifiques. Les méthodes décrites ici sont utiles pour identifier des allèles de risque et de leurs associations à caractères cliniques de façon relativement rapide et peu coûteuse. Cette plate-forme a été très avantageuse pour le dépistage et de diagnostic des fins5,6et plus récemment, pour les infections microbiennes7 et papillomavirus humain8.
Ce protocole commence par la sélection d’un ensemble de gènes pour enquête, i.e., les régions cibles, généralement déterminées par le biais de recherches documentaires ou des hypothèses a priori pour implication dans le processus de la maladie ; ou peut-être sélectionné pour la réplication, comme les principales associations d’une étude Génome-large association (GWA) de découverte. De l’ensemble de gènes, le chercheur choisira une liste raffinée du SNP. Autrement dit, le déséquilibre de liaison (LD), ou la corrélation, parmi les variantes dans la région sert à identifier un représentant « tag SNP » pour un groupe de SNP dans haute LD, connu comme un haplotype. Le LD haut de la région signifie que les SNP sont souvent hérités ensemble tel que génotypage un SNP est suffisant pour représenter la variation à tous les SNP dans l’haplotype. Alternativement, si suite à une liste définitive de SNP dans de nombreuses régions, par exemple., la réplication pour une étude GWA, ce processus peut être inutile. Pour le génotypage multiplexé, un test doit être conçu autour de ces cibles telles que les amorces d’amplification sont des différant en masse à ceux des amorces extension et spectres de masse de produits pour produire interprétable. Ces paramètres sont facilement mises en œuvre par un outil de conception de test de génotypage multiplexé. Les amorces et inverses de l’illustration servira à cibler les marqueurs d’intérêt et d’amplifier la séquence contenant le SNP. Les amorces extension attachent directement proximal des SNP et une base unique, masse modifié, « terminator » qui complète le SNP est ajoutée. La base de terminator empêche plus extension de l’ADN. La masse-modification de la base permet aux fragments qui diffère par une base unique pour être détectée par spectrométrie de masse. La plaque contenant la chimie de génotypage est ensuite appliquée à une puce pour la mesure sur une plate-forme de spectrométrie de masse. Après l’application des contrôles de qualité appropriés aux appels génotypage cru détectés par le système, les données peuvent être exportées et utilisées pour l’analyse statistique pour tester la liaison avec les phénotypes de la maladie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous démontrons la méthode de génotypage multiplexé, spectrométrie de masse. Les résultats représentatifs ont été générés à l’aide de la PCR jumelé avec MALDI-TOF spectrométrie de masse4 avec chimie dosage figurant dans le Tableau des matériaux13. Avec cette plate-forme, nous avons généré un total de 11 295 génotypes 1 255 personnes pour 9 SNP au sein de 40 h en laboratoire.
Nous illustrons l’utilité…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs n’ont aucun remerciements.
Materials
| Genomic DNA | – | – | 1 μL at a concentration of 5-10 ng/μL |
| Primers: forward and reverse amplification and extension | IDT | – | see manuscript section 1.2.1 on design of primers |
| Deionized water | E.g. Milli-Q water | – | deionized with 18.2 MΩ.cm resistivity |
| Genotyping reagent kit. iPLEX Gold Chemistry reagent set | Agena Bioscience | #10148-2 | includes all reagents for reactions in 2.2.1, 2.3.1 and 2.4.2 , chip and resin |
| PCR plates (384-well) | Abgene | #ABGAB-1384 | For the MassARRAY system plates by Abgene are compatible |
| Micropipettes | single and 8-channel | ||
| Centrifuge | compatible with 384-well plates | ||
| Thermocycler | compatible with PCR programs as detailed in 2.2.4, 2.3.2 and 2.4.3 | ||
| Dimple resin plate | Agena Bioscience | 6mg, 384-well | |
| Plate rotator | |||
| MassARRAY Analyzer 4 System | Agena Biosciences | MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight) Mass Spectrometer. | |
| RS1000 Nanodispenser | Agena Biosciences | ||
| Assay Design Suite | Agena Biosciences | Tool used to design the multiplex genotyping assays | |
| Hot Start Taq | DNA polymerase enzyme | ||
| Resin | Agena Biosciences | Supplied with iPLEX kit |
Referências
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