Een In Vitro Model voor het bestuderen van het Effect van Fotodynamische therapie 5-Aminolevulinic Zuur-gemedieerde op Staphylococcus aureus Biofilm
Summary
Dit manuscript beschrijft een protocol om te bestuderen van de antimicrobiële werking van 5-aminolevulinic zuur-gemedieerde Fotodynamische therapie (PDT-ALA) op een biofilm Staphylococcus aureus . Dit protocol kan worden gebruikt om een in vitro model om te bestuderen van de behandeling van bacteriële biofilms met PDT in de toekomst te ontwikkelen.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) is een gemeenschappelijke menselijke pathogenen, waardoor pyogenic en systemische infecties. S. aureus -infecties zijn moeilijk uit te roeien niet alleen te wijten aan de opkomst van antibiotica-resistente stammen, maar ook zijn vermogen om vorm biofilms. Fotodynamische therapie (PDT) heeft onlangs, is aangegeven als een van de mogelijke behandelingen voor het beheersen van biofilm infecties. Echter zijn verdere studies nodig om onze kennis van de invloed ervan op bacteriële biofilms, evenals de onderliggende mechanismen te verbeteren. Dit manuscript beschrijft een in vitro model van PDT met 5-aminolevulinic acid (5-ALA), een voorloper van de werkelijke fotosensitizer, protoporfyrine IX (PpIX). Kort, oudere S. aureus biofilms werden geïncubeerd met ALA en vervolgens blootgesteld aan het licht. Vervolgens was het antibacteriële effect van ALA-PDT op S. aureus biofilm gekwantificeerd door het berekenen van de kolonievormende eenheden (CFUs) en gevisualiseerd door levensvatbaarheid fluorescerende vlekken via confocale laser scanning microscopie (CLSM). Representatieve resultaten toonde een sterke antibacteriële werking van ALA-PDT op S. aureus biofilms. Dit protocol is eenvoudig en kan worden gebruikt voor het ontwikkelen van een in vitro model voor het bestuderen van de behandeling van S. aureus biofilms met ALA-PDT. Het kan in de toekomst ook in PDT studies met behulp van andere photosensitizers voor verschillende bacteriestammen met minimale aanpassingen worden verwezen.
Introduction
S. aureus is een belangrijke Gram-positive pathogenen die de huid en mucosa van menselijke gastheren koloniseert. Haar vermogen om vorm biofilms wordt beschouwd als een belangrijk aspect van de pathogenese1. Bacteriële biofilms zijn een Gemeenschap van bacteriën die zijn ingesloten in een zelf geproduceerde matrix, die is samengesteld uit de extracellulaire polymere stoffen, zoals polysacharide, DNA en proteïne. Deze matrix speelt een belangrijke rol in de persistentie van bacteriële infecties, bijgedragen tot een hoge mate van weerstand tegen het menselijke immuunsysteem en de huidige anti-microbiële therapieën2. Antibiotica zijn nog steeds de belangrijke behandeling tegen biofilms infecties, hoewel de effecten van antibiotica op biofilms beperkt zijn. Eerder is aangetoond dat cellen in biofilms 10 – 1000 keer meer resistent zijn tegen antibiotica vergeleken met hun tegenhangers van de planktonische3. Dus, alternatieve strategieën nodig zijn om het veroveren van deze kwestie.
PDT, een alternatieve behandeling van bacteriële infecties, wordt het licht van een passende golflengte om te activeren photosensitizers. Dit leidt tot de productie van reactieve zuurstof soorten (ROS), die dodelijk voor de doelcellen zijn door beschadiging van DNA4, verstoren de celwand en enzymen te inactiveren. Dit kenmerk voor meerdere doelen maakt het moeilijk voor bacteriën ontwikkelen resistentie tegen de behandeling met PDT.
De antimicrobiële effect van PDT op bacteriële en schimmelinfecties biofilms, met meerdere photosensitizers, zoals toluïdine blauw, groen Malachiet, methyleenblauw, chloor e6 en porphyrins, is bestudeerd in vorige verslagen5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, een voorstadium van de werkelijke fotosensitizer, PpIX, wordt gekenmerkt door zijn kleine moleculaire gewicht en de snelle goedkeuring12,14. Deze voordelen geven ALA-PDT groot potentieel als een therapeutische toepassing. Hoewel het effect van ALA-PDT op planktonische bacteriën is bestudeerd door vele groepen12, heeft het antimicrobiële effect van ALA-PDT op bacteriële biofilms niet toch geweest opgehelderd. Ondertussen is het moeilijk te vergelijken van de resultaten van eerdere studies. Een van de redenen is dat de verschillende protocollen worden gebruikt door diverse groepen. Dus, dit protocol beschrijft een in vitro model van een ALA-PDT-systeem is gebaseerd op onze eerdere werk15. Het effect van dit model werd bevestigd door CFU berekening en levensvatbaarheid kleuring met CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT is een goed bestudeerde therapie voor de behandeling van kanker sinds het werd meer dan 100 jaar geleden uitgevonden18. Het laatste decennium, PDT is toegepast als een antimicrobiële strategie en effectiviteit tegen sommige antibiotica-resistente ziekteverwekkende bacteriën12heeft aangetoond. Ten opzichte van de planktonische staat, bacteriële biofilms lijken te zijn meer resistent tegen antibiotica behandeling3, terwijl het effect van ALA-PDT…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door nationale aard Science Foundation van China voor jonge geleerden (nr. 81300810), Shanghai jonge arts trainingsprogramma (nr. 20141057), en nationale Natural Science Foundation van China (81671982, 81271791 en 81571955). We zouden graag bedanken LetPub (www.letpub.com) voor het verstrekken van taalkundige bijstand tijdens de voorbereiding van dit manuscript.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referências
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
