מודל ב חוץ גופית כדי לחקור את ההשפעה של טיפול פוטודינמי 5-Aminolevulinic חומצה-מתווכת על Staphylococcus aureus Biofilm
Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקול כדי לחקור את ההשפעה מיקרוביאלית של 5-aminolevulinic חומצה בתיווך טיפול פוטודינמי (ALA-PDT) על ממבנה biofilm Staphylococcus aureus . פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד לטיפול biofilms חיידקי עם PDT בעתיד.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) הוא. חיידק אנושית נפוצה, הגורמת זיהומים pyogenic ומערכתית. S. aureus זיהומים קשים להשמיד לא רק בשל הופעתה של זנים עמידים לאנטיביוטיקה, אלא גם את יכולתו ליצור biofilms. לאחרונה, כבר ציינו פוטודינמי תרפיה (PDT) בתור אחד של טיפולים פוטנציאליים לשליטה biofilm זיהומים. עם זאת, בהמשך מחקרים נדרשים כדי לשפר את הידע שלנו על השפעתו על biofilms חיידקי, כמו גם את המנגנונים המשמשת כבסיס. כתב יד זה מתאר מודל בתוך חוץ גופית של PDT עם 5-aminolevulinic חומצה (5-ALA), הקדמה על פוטוסנסיטייזר בפועל, protoporphyrin התשיעי (PpIX). בקצרה, בוגר S. aureus biofilms היו מודגרות עם ALA, ואז נחשף לאור. לאחר מכן, השפעת אנטיבקטריאלי ALA-PDT על S. aureus biofilm לכמת על-ידי חישוב המושבה יוצרי יחידות (CFUs), דמיינו ידי הכדאיות פלורסנט מכתים באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM). התוצאות נציג הפגינו השפעה אנטי-בקטריאלי חזק של ALA-PDT על biofilms S. aureus . פרוטוקול זה הוא פשוט והוא יכול לשמש כדי לפתח מודל במבחנה ללמוד הטיפול של S. aureus biofilms עם ALA-PDT. בעתיד, זה יכול גם להיות הפניה במחקרים PDT ניצול אחרים photosensitizers עבור זני חיידקים שונים עם התאמות מינימליות.
Introduction
S. aureus הוא הפתוגן גראם חיובי חשוב זה והצנרות את העור ורירית של בני-אדם כפונדקאים. היכולת שלה ליצור biofilms נחשב היבט חשוב של פתוגנזה שלו1. Biofilms חיידקי הם קהילה של חיידקים בתוך מטריצה מתוצרת עצמית, המורכב משילוב של חומרים פולימריים חוץ-תאית, כולל רב-סוכר, ה-DNA של חלבון. מטריצה זו ממלאת תפקיד משמעותי ההתמדה של זיהומים חיידקיים, לתרום רמה גבוהה של עמידות מערכת החיסון האנושית, טיפולים אנטי מיקרוביאליים הנוכחי2. אנטיביוטיקה הם עדיין הטיפול העיקריים עבור זיהומים biofilm, למרות השפעת אנטיביוטיקה על biofilms מוגבלים. הוכח בעבר כי תאים biofilms הם 10 – 1,000 פעמים יותר עמידים בפני אנטיביוטיקה לעומת עמיתיהם פלנקטוניים שלהם3. לפיכך, אסטרטגיות אלטרנטיביות יש צורך לכבוש את הבעיה.
PDT, טיפול חלופי עבור זיהומים חיידקיים, משתמשת אור באורך גל המתאים כדי להפעיל את photosensitizers. זה מוביל לייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS), אשר קטלניים לתאי המטרה על ידי שיבוש דופן התא, inactivating אנזימים, ומזיק דנ א4. מאפיין מטרות מרובות זה מקשה על חיידקים לפתח עמידות לטיפול PDT.
השפעת מיקרוביאלית PDT על biofilms חיידקים ופטריות, עם photosensitizers מרובים, כגון טולדין כחול, אנילין ירוק, כחול מתילן, כלור e6 ו porphyrins, נחקרה הקודם דוחות5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, prodrug של פוטוסנסיטייזר בפועל, PpIX, מאופיין על ידי שלה קטן משקל מולקולרי, סיווג מהירה12,14. יתרונות אלה לתת פוטנציאל מרכזי ALA-PDT כיישום טיפולית. למרות ההשפעה של ALA-PDT על חיידקים פלנקטוניים נחקרה על ידי קבוצות רבות12, ההשפעה מיקרוביאלית של ALA-PDT על biofilms חיידקי יש לא ובכל זאת כבר מבואר. בינתיים, קשה להשוות את התוצאות בין מחקרים קודמים. אחת מהסיבות היא כי הפרוטוקולים השונים משמשים על ידי קבוצות מגוונות. לפיכך, פרוטוקול זה מתאר מודל במבחנה של מערכת ALA-PDT בהתבסס על העבודה הקודמת שלנו15. ההשפעה של מודל זה אושר ע י חישוב CFU ואת הכדאיות מכתים עם CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT מאז טיפול למד היטב לטיפול בסרטן היא הומצאה לפני יותר מ-100 שנה18. במהלך העשור האחרון, PDT הוחל כמו אסטרטגיית מיקרוביאלית, הראה יעילות נגד כמה חיידקים פתוגניים עמידים לאנטיביוטיקה12. בהשוואה למצב פלנקטוניים, biofilms חיידקי מופיעים להיות עמידים יותר בפני טיפול אנטיביוט?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומן על ידי הלאומי הטבע מדעי היסוד של סין עבור חוקרים צעירים (מספר 81300810), רופא צעיר שנגחאי תוכנית אימונים (מספר 20141057) הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (81671982, 81271791 ו- 81571955). ברצוננו להודות LetPub (www.letpub.com) על מתן סיוע לשוני במהלך הכנת כתב היד הזה.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
Referências
- Lewis, K. Riddle of biofilm resistance. Antimicrob Agents Chemother. 45 (4), 999-1007 (2001).
- Rabin, N., et al. Biofilm formation mechanisms and targets for developing antibiofilm agents. Future Med Chem. 7 (4), 493-512 (2015).
- Mah, T. F., O’Toole, G. A. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol. 9 (1), 34-39 (2001).
- Sharma, M., et al. Toluidine blue-mediated photodynamic effects on staphylococcal biofilms. Antimicrob Agents Chemother. 52 (1), 299-305 (2008).
- Rosa, L. P., da Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. In vitro effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy (APDT) using a 660 nm laser and malachite green dye in Staphylococcus aureus biofilms arranged on compact and cancellous bone specimens. Lasers Med Sci. 29 (6), 1959-1965 (2014).
- Rosa, L. P., Silva, F. C., Nader, S. A., Meira, G. A., Viana, M. S. Effectiveness of antimicrobial photodynamic therapy using a 660 nm laser and methyline blue dye for inactivating Staphylococcus aureus biofilms in compact and cancellous bones: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 12 (2), 276-281 (2015).
- Mai, B., et al. The antibacterial effect of sinoporphyrin sodium photodynamic therapy on Staphylococcus aureus planktonic and biofilm cultures. Lasers Surg Med. 48 (4), 400-408 (2016).
- Gandara, L., Mamone, L., Bohm, G. C., Buzzola, F., Casas, A. Enhancement of photodynamic inactivation of Staphylococcus aureus biofilms by disruptive strategies. Lasers Med Sci. 32 (8), 1757-1767 (2017).
- Baltazar, L. M., et al. Antimicrobial photodynamic therapy: an effective alternative approach to control fungal infections. Front Microbiol. 6, 202 (2015).
- Fernandes, T., Bhavsar, C., Sawarkar, S., D’Souza, A. Current and novel approaches for control of dental biofilm. Int J Pharm. 536 (1), 199-210 (2017).
- De Sordi, L., et al. Development of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) for Clostridium difficile. PLoS One. 10 (8), e0135039 (2015).
- Harris, F., Pierpoint, L. Photodynamic therapy based on 5-aminolevulinic acid and its use as an antimicrobial agent. Med Res Rev. 32 (6), 1292-1327 (2012).
- Donnelly, R. F., McCarron, P. A., Tunney, M. M. Antifungal photodynamic therapy. Microbiol Res. 163 (1), 1-12 (2008).
- Shi, H., Li, J., Zhang, H., Zhang, J., Sun, H. Effect of 5-aminolevulinic acid photodynamic therapy on Candida albicans biofilms: An in vitro study. Photodiagnosis Photodyn Ther. 15, 40-45 (2016).
- Zhang, Q. Z., et al. 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy and its strain-dependent combined effect with antibiotics on Staphylococcus aureus biofilm. PLoS One. 12 (3), 0174627 (2017).
- Chang, Y. C., et al. Rapid single cell detection of Staphylococcus aureus by aptamer-conjugated gold nanoparticles. Sci Rep. 3, 1863 (2013).
- Barra, F., et al. Photodynamic and Antibiotic Therapy in Combination to Fight Biofilms and Resistant Surface Bacterial Infections. Int J Mol Sci. 16 (9), 20417-20430 (2015).
- St Denis, T. G., et al. All you need is light: antimicrobial photoinactivation as an evolving and emerging discovery strategy against infectious disease. Virulence. 2 (6), 509-520 (2011).
- O’Neill, J. F., Hope, C. K., Wilson, M. Oral bacteria in multi-species biofilms can be killed by red light in the presence of toluidine blue. Lasers Surg Med. 31 (2), 86-90 (2002).
- Li, X., et al. Effects of 5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy on antibiotic-resistant staphylococcal biofilm: an in vitro study. J Surg Res. 184 (2), 1013-1021 (2013).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nat Rev Microbiol. 2 (2), 95-108 (2004).
- Elias, S., Banin, E. Multi-species biofilms: living with friendly neighbors. FEMS Microbiol Rev. 36 (5), 990-1004 (2012).
- Wu, J., et al. Design and Proof of Programmed 5-Aminolevulinic Acid Prodrug Nanocarriers for Targeted Photodynamic Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 9 (17), 14596-14605 (2017).
