Un modello In Vitro per studiare l'effetto della terapia fotodinamica 5-aminolevulinico-mediata su Staphylococcus aureus Biofilm
Summary
Questo manoscritto descrive un protocollo per studiare l’effetto antimicrobico della terapia fotodinamica mediata da acido 5-aminolevulinico (ALA-PDT) su un biofilm di Staphylococcus aureus . Questo protocollo può essere usato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm batterici con PDT in futuro.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) è un agente patogeno umano comune, che provoca infezioni pyogenic e sistemiche. Le infezioni da S. aureus sono difficili da sradicare non solo causa la comparsa di ceppi resistenti agli antibiotici, ma anche la capacità di forma biofilm. Recentemente, la terapia fotodinamica (PDT) è stata indicata come uno dei potenziali trattamenti per controllare le infezioni biofilm. Tuttavia, ulteriori studi sono richiesti per migliorare la nostra conoscenza del suo effetto sul biofilm batterici, come pure i meccanismi di fondo. Questo manoscritto descrive un modello in vitro di PDT con acido 5-aminolevulinico (5-ALA), un precursore del fotosensibilizzatore effettivo, la protoporfirina IX (PpIX). Maturo, brevemente, lo Staphylococcus aureus biofilm sono stati incubati con ALA e quindi esposti alla luce. Successivamente, l’effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus è stato quantificato calcolando l’unità (CFUs) di formazione di colonie e visualizzata da vitalità fluorescente colorazione tramite laser confocale microscopia (CLSM). Risultati rappresentativi hanno dimostrato un forte effetto antibatterico di ALA-PDT il biofilm di S. aureus . Questo protocollo è semplice e può essere utilizzato per sviluppare un modello in vitro per studiare il trattamento di biofilm di S. aureus con ALA-PDT. In futuro, potrebbe anche fare riferimento a studi di PDT che utilizzano altri fotosensibilizzanti per differenti ceppi batterici con minimo aggiustamento.
Introduction
S. aureus è un importante patogeno gram-positivo che colonizza la pelle e delle mucose degli umani. Sua capacità di forma biofilm è considerato un aspetto importante della sua patogenesi1. Biofilm batterici sono una comunità di batteri incorporati in una matrice autoprodotta, che è composto di sostanze polimeriche extracellulari, inclusi polisaccaride, DNA e proteine. Questa matrice gioca un ruolo significativo nella persistenza di infezioni batteriche, che contribuiscono ad un alto grado di resistenza per il sistema immunitario umano e attuale terapie anti-microbica2. Gli antibiotici sono ancora il principale trattamento per biofilm infezioni, anche se gli effetti degli antibiotici il biofilm sono limitati. Ha dimostrato in precedenza che le cellule nei biofilm sono 10 – 1.000 volte più resistente agli antibiotici rispetto ai loro omologhi planctonici3. Così, sono necessarie strategie alternative per conquistare questo problema.
PDT, un trattamento alternativo per le infezioni batteriche, usa la luce di una lunghezza d’onda appropriata per attivare fotosensibilizzanti. Questo porta alla produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS), che sono letali per le cellule bersaglio di perturbare la parete cellulare, enzimi inattivanti e danneggiare il DNA4. Questa caratteristica multi-target rende difficile per i batteri di sviluppare resistenza al trattamento PDT.
L’effetto antimicrobico di PDT il biofilm batterici e fungini, con più fotosensibilizzanti, come il blu di toluidina, verde malachite, blu di metilene, cloro e6 e porfirine, è stato studiato in precedenti relazioni5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profarmaco del fotosensibilizzatore effettivo, PpIX, è caratterizzato dal suo peso molecolare e uno sdoganamento rapido12,14. Questi vantaggi danno potenziale principali ALA-PDT come un’applicazione terapeutica. Anche se l’effetto di ALA-PDT sui batteri planctonici è stato studiato da molti gruppi12, l’effetto antimicrobico di ALA-PDT il biofilm batterici non è stata ancora chiarita. Nel frattempo, è difficile confrontare i risultati tra gli studi precedenti. Uno dei motivi è che i diversi protocolli vengono utilizzati da gruppi diversi. Così, questo protocollo descrive un modello in vitro di un sistema di ALA-PDT basato sul nostro lavoro precedente15. L’effetto di questo modello è stata confermata da calcolo CFU e vitalità colorazione con CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT è stata una terapia ben studiata per il trattamento del cancro, quando è stato inventato più di 100 anni fa18. Nell’ultimo decennio, è stata applicata come una strategia antimicrobica e ha indicato l’efficacia contro alcuni batteri patogeni resistenti agli antibiotici12PDT. Rispetto allo stato planctonico, biofilm batterici sembrano essere più resistenti al trattamento antibiotico3, mentre l’effetto di ALA-PDT il biofilm non è stato complet…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienza natura della Cina per giovani studiosi (No. 81300810), programma di formazione di Shanghai il giovane dottore (No. 20141057) e National Natural Science Foundation of China (81671982, 81271791 e 81571955). Vorremmo ringraziare LetPub (www.letpub.com) per fornire assistenza linguistica durante la preparazione di questo manoscritto.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
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