Un modelo In Vitro para estudiar el efecto de la terapia fotodinámica mediada por el ácido aminolevulínico 5 de Biofilm de Staphylococcus aureus
Summary
Este manuscrito describe un protocolo para estudiar el efecto antimicrobiano de terapia fotodinámica mediada por el ácido de 5-aminolevulínico (ALA-PDT) en el biofilm de Staphylococcus aureus . Este protocolo puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms bacterianos con TFD en el futuro.
Abstract
Staphylococcus aureus (S. aureus) es un patógeno humano común, que causa infecciones piógenas y sistémicas. S. aureus las infecciones son difíciles de erradicar no sólo debido a la aparición de cepas resistentes a los antibióticos pero también su capacidad de forma biofilms. Recientemente, la terapia fotodinámica (TFD) ha indicado como uno de los posibles tratamientos para el control de las infecciones de biofilm. Sin embargo, se necesitan estudios adicionales para mejorar nuestro conocimiento de su efecto sobre biofilms bacterianos, así como los mecanismos subyacentes. Este manuscrito describe un modelo in vitro de la TFD con ácido 5-aminolevulínico (5-ALA), un precursor de la actual fotosensibilizador, protoporfirina IX (PpIX). Brevemente, maduro S. aureus biopelículas fueron incubados con ALA y entonces expuestos a la luz. Posteriormente, el efecto antibacteriano de ALA-PDT en el biofilm de S. aureus fue cuantificado calculando las colonias formando unidades (UFC) y visualizado por tinción mediante láser confocal de barrido (CLSM) la microscopia fluorescente de viabilidad. Resultados representativos demostraron un fuerte efecto antibacteriano de ALA-PDT en biopelículas de S. aureus . Este protocolo es simple y puede utilizarse para desarrollar un modelo de vitro para estudiar el tratamiento de los biofilms de S. aureus con ALA-PDT. En el futuro, también podría hacer referencia en los estudios de PDT utilizando otros photosensitizers por diferentes cepas bacterianas con ajustes mínimos.
Introduction
S. aureus es un importante patógeno gram-positivo que coloniza la piel y mucosa de los ejércitos humanos. Su capacidad de forma biofilms se considera un aspecto importante de su patogenesia1. Biofilms bacterianos son una comunidad de bacterias embebidas en una matriz de producción propia, que se compone de sustancias poliméricas extracelulares, incluyendo polisacárido, ADN y proteínas. Esta matriz juega un papel importante en la persistencia de las infecciones bacterianas, que contribuyen a un alto grado de resistencia al sistema inmunológico humano y terapias antimicrobianas actuales2. Antibióticos siguen siendo el tratamiento principal para las infecciones de biofilm, aunque los efectos de los antibióticos en los biofilms son limitados. Previamente se ha demostrado que las células en los biofilms son 10 a 1.000 veces más resistentes a los antibióticos en comparación con sus contrapartes planctónicas3. Así, se necesitan estrategias alternativas para vencer este problema.
PDT, un tratamiento alternativo para las infecciones bacterianas, utiliza la luz de una longitud de onda adecuada para activar photosensitizers. Esto conduce a la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS), que son letales a las células diana por alterar la pared celular, inactivar enzimas y dañando DNA4. Esta característica de destino múltiples hace difícil para las bacterias desarrollar resistencia al tratamiento de PDT.
El efecto antimicrobiano de la TFD en biofilms de bacterianos y hongos, con photosensitizers múltiples, tales como azul de toluidina, verde malaquita, azul de metileno, cloro e6 y las porfirinas, se ha estudiado en anteriores informes5,6, 7,8,9,10,11,12,13. 5-ALA, un profármaco de la real fotosensibilizador, PpIX, se caracteriza por su pequeño peso molecular y separación rápida12,14. Estas ventajas dan gran potencial ALA-PDT como un uso terapéutico. Aunque el efecto de ALA-PDT en bacterias planctónicas ha sido estudiado por muchos grupos12, el efecto antimicrobiano de ALA-PDT en biopelículas bacterianas ha todavía no se ha aclarado. Mientras tanto, es difícil comparar los resultados entre los estudios previos. Una de las razones es que los diferentes protocolos son utilizados por diversos grupos. Así, este protocolo describe un modelo en vitro de un sistema de ALA-PDT basado en nuestro anterior trabajo15. El efecto de este modelo fue confirmado por cálculo de UFC y viabilidad de tinción con CLSM.
Protocol
Representative Results
Discussion
PDT ha sido una terapia muy estudiada para el tratamiento del cáncer desde que fue inventado hace más de 100 años18. En la última década, PDT ha sido aplicada como una estrategia antimicrobiana y ha mostrado eficacia contra algunas bacterias patógenas resistentes a los antibióticos12. En comparación con el estado planctónico, biopelículas bacterianas parecen ser más resistentes al tratamiento antibiótico3, mientras que el efecto de ALA-PD…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la nacional naturaleza ciencia Fundación de China para jóvenes académicos (Nº 81300810), programa de formación de médico joven de Shangai (Nº 20141057) y Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81671982, 81271791 y 81571955). Nos gustaría dar las gracias a LetPub (www.letpub.com) para prestar asistencia lingüística durante la preparación de este manuscrito.
Materials
| Tryptone Soya Broth (TSB) | OXOID | CM0129B | |
| Tryptone Soya Agar (TSA) | OXOID | CM0131 | |
| SYTO9 | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Propidium iodide (PI) | Thermo Fisher Scientific | L7012 | The LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kits |
| Pancreatin | Sigma-Aldrich | P3292 | |
| 5-aminolevulinic acid (ALA) | Fudan Zhangjiang Bio-Pharm | 3.1 | |
| Staphylococcus aureus strain USA300 | / | / | The source of USA 300 references “Tenover FC, Goering RV. J Antimicrob Chemother. 2009 Sep; 64(3):441-6”. |
| Staphylococcus aureus clinical strains (C1-C3) | / | / | All clinical strains were isolated from patients with chronic rhinosinusitis in the Department of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery, Eye and ENT Hospital of Fudan University [Zhang QZ, Zhao KQ, Wu Y, et al. PLoS One. 2017 Mar; 12(3): e0174627]. |
| 96-well microplate | Corning Inc | 3599 | Clear Flat Bottom Polystyrene TC-Treated Microplates, Individually Wrapped, with Lid, Sterile |
| Fluorodish | NEST Biotechnology | 801001 | Glass bottom, Non-pyrogenic |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| Eppendorf microcentrifuge 5417 | Eppendorf | Z365998 | SIGMA | |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | SHKE4000 | MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shakers |
| Light emitting diode (LED) | Wuhan Yage Optic and Electronic Technique CO | LED-IB | |
| Leica TCS SP8 confocal laser-scanning microscope | Leica Microsystems | ||
| Leica LAS AF software | Leica Microsystems | ||
| IMARIS software | Bitplane |
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