Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto
Summary
Aqui, descrevemos o isolamento de células gliais-entérico da submucosa intestinal-usando sequencial incubação do EDTA para quelato cátions divalentes e, em seguida, incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos. Chapeamento da suspensão de células resultante na poli-D-lisina e laminina resulta em uma cultura altamente enriquecida de células gliais submucosas para análise funcional.
Abstract
O sistema nervoso entérico (ENS) consiste de neurônios e células gliais entéricas (EGCs) que residem dentro da parede músculo liso, a submucosa e a propria do lamina. EGCs desempenham um papel importante na homeostase do intestino através da liberação de vários fatores tróficos e contribuam para a integridade da barreira epitelial. A maioria dos estudos de culturas primárias de gliais entéricas usar células isoladas do Plexo mioentérico após dissociação enzimática. Aqui, um método não-enzimática para isolar e cultura EGCs da lâmina própria e submucosa intestinal é descrito. Após a remoção manual da camada muscular longitudinal, EGCs foram libertados da lâmina própria e submucosa usando sequencial incubação do tampão HEPES EDTA seguida de incubação em solução de recuperação de célula não enzimáticos comercialmente disponível. A incubação do EDTA foram suficientes para tirar a maioria da mucosa epitelial da lâmina própria, permitindo que a solução de recuperação de célula libertar os EGCs submucosas. Qualquer residual propria do lamina e músculo liso foi descartada juntamente com a mioentérico glia. EGCs foram facilmente identificados pela sua capacidade de expressar a proteína ácida fibrilar glial (GFAP). Apenas cerca de 50% de suspensão de célula continha células GFAP + depois de completar a incubação do tecido e antes do revestimento sobre o substrato de poli-D-lisina/laminina. No entanto, após 3 dias de cultivo as células no fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF)-contendo meios de cultura, a população de células aderindo ao substrato revestido placas composta de > 95% entérica glia. Criamos uma linha de rato híbrido criando um mouse hGFAP-Cre para a linha de repórter ROSA-tdTomato acompanhe a porcentagem de células GFAP + usando fluorescência da célula endógena. Assim, não-mioentérico entérica glia pode ser isolado por meio de métodos não enzimáticos e cultivada pelo menos 5 dias.
Introduction
Interesse na função de células gliais entéricas (EGCs) aumentou constantemente devido a seus papéis reconhecidos no intestino integridade e homeostase1,2. Além disso, o EGCs variam de acordo com sua localização ao longo do comprimento do trato GI3,4. EGCs liberar vários fatores tróficos, incluindo o fator neurotrófico derivado de células gliais (GDNF), contribuem para estripar motilidade1,5 e responder a subprodutos microbiana6,7. Estudos têm indicado que a população de EGC é heterogênea e que sua função varia dependendo se eles são submucosos ou residam dentro a mioentérico plexo1,7. Por exemplo, EGCs dentro da submucosa contribuam para junções apertadas8. Expressão de GFAP e fosforilação em EGCs diferencial têm sido associados à doença de Parkinson, sugerindo sua possível ligação com o fenótipo de intestino desta desordem9. Recentemente, observou-se que a perda de proteína nuclear oshomens em culturas isoladas de EGCs da submucosa intestinal proximal foi suficiente para induzir a expressão do hormônio gastrina10. Como resultado, foi proposto que o EGCs podem ser a origem dos gastrinomas duodenais, um tipo de tumor neuroendócrino10. Coletivamente, estes exemplos ressaltam a relevância de estudar o comportamento e a função do EGCs isolados em transtornos neuropáticas e câncer11.
O desafio no campo permanece como isolar e estudar um ou ambos os EGC populações em vitro. Experimentos de rastreamento de linhagem demonstrado que EGCs na lâmina própria e submucosa se originam de células progenitoras no Plexo mioentérico7. Embora existam vários protocolos de isolamento publicado disponível para gerar culturas de mioentérico EGCs12,13,14,15,16,17, 18,19, nenhum especificamente destinos isolamento da população de EGC submucosa/lamina propria. Protocolos existentes para isolamento de EGC especificamente usam uma combinação da separação mecânica ou o microdissection do músculo liso combinado com dissociação enzimática, eventualmente, descartando a camada de células da mucosa.
O objetivo deste manuscrito é demonstrar as etapas para isolar não-enzimaticamente EGCs primários da propria do lamina para estudos em vitro . Uma vez que não há marcadores que especificamente distinguem a mioentérico EGCs na submucosa, a separação espacial da mucosa epitelial de musculatura lisa foi explorada para isolar o EGCs submucosas. Além disso, através da combinação de EDTA com dissociação não enzimáticos, EGCs foram isolados da submucosa em contraste com o músculo liso, que foi descartado junto com os EGCs intermioentérico associado. Mais separação da submucosa e propria do lamina EGCs ocorreu por cultivo as células gliais substratos de célula-amigável, por exemplo, poli-D-lisina e laminina.
Protocol
Representative Results
Discussion
EGCs desempenham um papel importante na homeostase do intestino, e é essencial para isolar e estudá-los em vitro. Neste protocolo, um método simples para isolar o EGCs partir a lâmina própria do intestino rato adulto foi introduzido para estudar a função glia entérica.
Removendo o mesentério aderente e LMMP com um cotonete de algodão remove alguns da mioentérico inter glia que residem entre o músculo longitudinal e circular, aumenta a acessibilidade de buffers para a super…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam reconhecer o apoio da DK045729 R37 (a JLM), R01 AR060837 (para HX) e a Universidade de Michigan Gastrointestinal Research Center Molecular Core DK034933 P30.
Materials
| Poly-D lysine (1 mg/ml stock) | Sigma | A-003-E | Dilute 1:10 |
| Laminin (0.5 mg/ml stock) | Sigma | L4544 | Dilute to 10 µg/mL on ICE |
| EDTA (0.5M) | Lonza | 51201 | Dilute 1:100 in DPBS |
| HEPES (1 M) | Corning | 36216004 | Dilute 1:100 in DPBS |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | HyClone | SH30028.02 | |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 11320033 | |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Life Technologies | 15140-122 | |
| Gentamicin (50mg/mL stock) | Life Technologies | 15750060 | |
| GDNF (10 µg stock) | Sigma | SRP3200 | |
| L-Glutamine (200 mM stock) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Chicken anti-GFAP | Thermo Fisher Scientific | PA1-10004 | |
| Goat anti-a-Smooth Muscle Actin | Abcam | ab112022 | |
| Mouse anti-Pgp9.5 | Novus Biologicals | NB600-1160 | |
| Goat anti-E-cadherin | R&D Systems | AF748 | |
| Rabbit S100 | Abcam | ab34686 | |
| Mouse p75 NTR | Millipore | MAB5592 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken IgY | Invitrogen | A-11039 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11004 | |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | R-37119 | |
| Prolong Gold antifade Reagent with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| Fungizone (Amphotericin B) 250 µg/ml | Life Technologies | 15290-018 | |
| L-Fura-2-AM | Invitrogen | F-14201 | |
| CCK peptide | Anaspec, Fremont, CA | AS-20741 | |
| Gastrin peptide (Gastrin-17) | Abbiotec, Bloomington, IN | 350188 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (100 µm) | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Nylon Mesh Celll Strainer (40 µm) | Fisher Scientific | 22363547 | |
| Disposable Serologic Pipet 5 ml | Fisher Scientific | 13-678-11D | |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Life Technologies | 25200-056 |
Referências
- Grubisic, V., Gulbransen, B. D. Enteric glia: the most alimentary of all glia. Journal of Physiology. 595 (2), 557-570 (2017).
- Gulbransen, B. D., Sharkey, K. A. Novel functional roles for enteric glia in the gastrointestinal tract. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 9 (11), 625-632 (2012).
- Rao, M., et al. Enteric Glia Regulate Gastrointestinal Motility but Are Not Required for Maintenance of the Epithelium in Mice. Gastroenterology. 153 (4), 1068-1081 (2017).
- Rao, M., et al. Enteric glia express proteolipid protein 1 and are a transcriptionally unique population of glia in the mammalian nervous system. Glia. , (2015).
- McClain, J., et al. Ca2+ responses in enteric glia are mediated by connexin-43 hemichannels and modulate colonic transit in mice. Gastroenterology. 146 (2), 497-507 (2014).
- Cunha Franceschi, R., et al. Enteric glial reactivity to systemic LPS administration Changes in GFAP and S100B protein. Neuroscience Research. 119, 15-23 (2017).
- Kabouridis, P. S., et al. Microbiota controls the homeostasis of glial cells in the gut lamina propria. Neuron. 85 (2), 289-295 (2015).
- Yu, Y. B., Li, Y. Q. Enteric glial cells and their role in the intestinal epithelial barrier. World Journal of Gastroenterology. 20 (32), 11273-11280 (2014).
- Clairembault, T., et al. Enteric GFAP expression and phosphorylation in Parkinson’s disease. Journal of Neurochemistry. 130 (6), 805-815 (2014).
- Sundaresan, S., et al. Gastrin Induces Nuclear Export and Proteasome Degradation of Menin in Enteric Glial Cells. Gastroenterology. 153, 1555-1567 (2017).
- Gulbransen, B. D. Enteric Glia: The Origin of Duodenal Gastrinomas?. Gastroenterology. , (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), (2013).
- Fried, D. E., Gulbransen, B. D. In situ Ca2+ imaging of the enteric nervous system. Journal of Visualized Experiments. (95), (2015).
- Bernstein, C. N., Vidrich, A. Isolation, identification, and culture of normal mouse colonic glia. Glia. 12 (2), 108-116 (1994).
- Jaeger, C. B. Isolation of enteric ganglia from the myenteric plexus of adult rats. Journal of Neural Transplantation & Plasticity. 5 (4), 223-232 (1995).
- Almond, S., Lindley, R. M., Kenny, S. E., Connell, M. G., Edgar, D. H. Characterisation and transplantation of enteric nervous system progenitor cells. Gut. 56 (4), 489-496 (2007).
- Ruhl, A., Trotter, J., Stremmel, W. Isolation of enteric glia and establishment of transformed enteroglial cell lines from the myenteric plexus of adult rat. Neurogastroenterology & Motility. 13 (1), 95-106 (2001).
- Boyen, G. B., et al. Distribution of enteric glia and GDNF during gut inflammation. BMC Gastroenterology. 11, 3 (2011).
- Rosenbaum, C., et al. Activation of Myenteric Glia during Acute Inflammation In Vitro and In Vivo. Public Library of Science One. 11 (3), e0151335 (2016).
- Zhuo, L., et al. hGFAP-cre transgenic mice for manipulation of glial and neuronal function in vivo. Genesis. 31 (2), 85-94 (2001).
- Boesmans, W., Lasrado, R., Vanden Berghe, P., Pachnis, V. Heterogeneity and phenotypic plasticity of glial cells in the mammalian enteric nervous system. Glia. 63 (2), 229-241 (2015).
- Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nature Biotechnology. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Kabouridis, P. S., et al. The gut microbiota keeps enteric glial cells on the move; prospective roles of the gut epithelium and immune system. Gut Microbes. 6 (6), 398-403 (2015).
- Pomeranz, H. D., Sherman, D. L., Smalheiser, N. R., Tennyson, V. M., Gershon, M. D. Expression of a neurally related laminin binding protein by neural crest-derived cells that colonize the gut: relationship to the formation of enteric ganglia. The Journal of Comparative Neurology. 313 (4), 625-642 (1991).
