Mikroglia sind immun Gehirnzellen, die Umfrage und reagieren auf veränderte Gehirnphysiologie durch morphologische Veränderungen, die quantitativ ausgewertet werden kann. Dieses Protokoll beschreibt eine ImageJ basierte Analyse Protokoll, Mikroglia Morphologie als kontinuierliche Daten nach Metriken wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form darzustellen.
Mikroglia sind Gehirn Fresszellen, die im Gehirn Homöostase teilnehmen und kontinuierlich vermessen ihr Umfeld für Funktionsstörungen, Verletzungen und Krankheiten. Als die first Responder Mikroglia haben wichtige Funktionen, Neuronen und Glia Dysfunktion zu mildern, und in diesem Prozess durchlaufen sie eine breite Palette von morphologischen Veränderungen. Mikroglia Morphologien können deskriptiv eingestuft werden oder alternativ als eine kontinuierliche Variable Parameter wie Zelle Verzweigung, Komplexität und Form quantifiziert werden können. Während Methoden zur Quantifizierung der Mikroglia auf einzelne Zellen angewendet werden, gelten einige Techniken für mehrere Mikroglia in eine gesamte Mikrophotographie. Der Zweck dieser Methode ist, mehrere zu quantifizieren und Einzelzellen mit leicht verfügbaren ImageJ-Protokolle. Dieses Protokoll ist eine Zusammenfassung der Schritte und ImageJ Plugins empfohlen, Fluoreszenz und Hellfeld Vergößerung in repräsentativen binäre und skelettierten Bilder umzuwandeln und zu analysieren mit Software-Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D) und FracLac für die Datenerfassung der Morphologie. Die Ausgänge dieser Plugins zusammenfassen Zellmorphologie Prozess Endpunkte, Kreuzungen, und Länge sowie Komplexität, Zelle Form und Größe Deskriptoren. Das Skelett Analyse Protokoll beschriebenen eignet sich gut für eine regionale Analyse von mehreren Mikroglia innerhalb eines gesamten Mikrophotographie oder Region of Interest (ROI), während FracLac eine ergänzende individuelle Zellanalyse bietet. Kombiniert, sieht das Protokoll ein objektives, sensible und umfassende Bewertungswerkzeug, das verwendet werden, um zwischen vielfältigen Mikroglia Morphologien im Gehirn gesund und Verletzten zu Schichten.
Mikroglia haben eine sofortige und vielfältigen morphologischen Antwort auf Veränderungen im Gehirn Physiologie1 entlang eines Kontinuums von Möglichkeiten dieses Bereichs von hyper-Verzweigung und hochkomplexe Morphologien, de-verzweigten und amöboiden Morphologien2 . Mikroglia kann auch polarisiert und stabförmige3geworden. Mikroglia Zelle Verzweigung wird im Allgemeinen als eine komplexe Form mit mehreren Prozessen definiert und wird oft als die Anzahl der Endpunkte pro Zelle und die Länge der Zelle Prozesse berichtet. Da Mikroglia sind abgestimmt auf neuronalen und Gliazellen Funktion durch kontinuierliche Zellezelle Übersprechen und in Vivo Motilität4,5, können als Indikatoren für verschiedene Zellfunktionen und Dysfunktionen Mikroglia Morphologien dienen. im Gehirn. Ein quantitativer Ansatz ist notwendig, um die Vielfalt dieser morphologischen Veränderungen angemessen zu beschreiben und die Unterschiede zwischen den verzweigten Zellen zu unterscheiden, die mit subtilen physiologische Störungen (z. B. Epilepsie5,6 auftreten und Gehirnerschütterung7) zusätzlich zu grobe Verletzungen (z. B. Takt8). Ein vermehrter Einsatz von Morphologie Quantifizierung7,8,9,10,11,12,13,14 zeigen die ganze Vielfalt der Mikroglia Morphologien in Gesundheit und Krankheit. Die vorliegende Studie Details der schrittweise Einsatz von ImageJ Plugins notwendig, Mikroglia Morphologie von Leuchtstofflampen oder nicht-fluoreszierende Vergößerung der Mikroglia zusammenfassen in festen Nagetier Gewebe nach Immunhistochemie (IHC) erworben.
Im Mittelpunkt stehen, die Analyse-Techniken, die hier beschriebenen die ImageJ Plugins AnalyzeSkeleton (2D/3D)15, entwickelt im Jahr 2010 auf große Mamma Strukturen, zu quantifizieren und FracLac16, entwickelt im Jahr 2014 auf ImageJ und Fraktal-Analyse zu integrieren einzelnen Mikroglia Formen zu quantifizieren. Diese Plugins bieten eine schnelle Analyse der Mikroglia Verzweigung im gesamten Mikrofotos oder mehrere Mikroglia einen definierten ROI innerhalb einer Mikrophotographie. Diese Analyse kann alleine oder in Ergänzung mit Fraktalanalyse verwendet werden. Die einzelligen Fraktalanalyse (FracLac) erfordert eine Investition von Zeit, sondern bietet mehrere Morphologie Ausgaben bezüglich Mikroglia Komplexität, Form und Größe. Die Verwendung beider Tools ist nicht überflüssig, als Zelle Verzweigung ist komplementär zur Zelle Komplexität und die Kombination von mehreren Parametern verwendet werden, zu unterscheiden zwischen verschiedenen Mikroglia Morphologien in Datasets12,17.
Mikroglia-Zellen sind abgestimmt auf die Physiologie und Pathologie innerhalb ihrer mikrodomänen und ein breites Spektrum von Morphologien2 im subtilen7,14 und grober Verletzung8anzeigen. Die Verwendung von ImageJ Protokollen macht Mikroglia Morphologie Quantifizierung als Plattform für alle Laboratorien zugänglich und Plugins sind ein Open-Source-Bildbearbeitungsprogramm. Während die beschriebene Protokoll auf Bildverarbeitung und-Analyse mit dieser Software gerichtet ist, beginnt die Konsistenz der Datensammlung, Validität und Reliabilität mit ausgezeichneten IHC und Mikroskopie. Dieses Protokoll wird verwendet, um binäre, Skelett und Gliederung Darstellungen der gesamten Mikrofotos und Einzelzellen zu verbessern, aber kann nicht an die Stelle der Armen IHC beflecken und Mikroskopie, die Ergebnisse in geringem Kontrast, unscharf oder verzerrt Bilder. Als eine weitere Überlegung muss darauf geachtet werden, nicht auf das Hirngewebe während der Lagerung vor dem Schneiden, glätten, das Mikroglia Morphologie unwiderruflich verändert. Zu guter Letzt muss innerhalb jedes Experiment Mikroglia abgebildet werden mit der gleichen Skala sowie die gleichen Mikroskop. Instrumentierung, Ziele und Software variieren unter Mikroskopen die führen zu unterschiedlicher Größe Mikrofotos trotz ähnlicher Zielsetzung und ändern Sie die Details sowie die Anzahl der Zellen in jedem Frame. Bildaufnahme mit einem 40 X Objektiv auf eine Leica SPII ergibt beispielsweise zweimal die Anzahl der Zellen und weniger Details als Erwerb mit einem Zeiss-880. Dies ist besonders wichtig für die Zelle Verzweigung Daten aus den gesamten Rahmen, anstatt eine einzelne Zelle, da dies ein Problem der Daten Probenahme wird.
In der Regel vorausgeht Skelett Analyse, die die gesamte Mikrophotographie nutzt die einzelne Zelle Fraktal-Analyse aus zwei Gründen. Bestimmende Zelle Verzweigung aller Zellen in einem Mikrophotographie ist schnell im Vergleich zu der einzelnen Zelle Fraktalanalyse und als ein Screening-Instrument angesehen werden, kann wenn Zeit ein Faktor ist. Darüber hinaus werden die binären Bildern abgeleitet während Skelett Analyse für Fraktalanalyse verwendet. Sobald ein Image erstellt, gibt es eine Reihe von kritischen Schritte, die Einfluss Skelett Analyseergebnisse und Benutzer-Einfluss vorstellen kann. Die Protokoll-Schritte, die meisten variabel zwischen Benutzern sind Schritt 4.2 (zunehmende Helligkeit) und 4,5 (Bestimmung des Schwellenwerts). Soweit möglich, wird eine optimale Anzahl Erhöhung der Helligkeit (Max oder min Schieberegler zwischen 0-255) bestimmt und für alle Bilder und Anwender konstant gehalten. Wo Bild Variabilität groß ist, können die Benutzer stattdessen eine Helligkeit, die zwischen den Bildern variieren. Alternativ, wenn Bilder hell sind und Kontrast hoch ist, dann Helligkeit erhöhen kann weggelassen werden und Schwellwerte kann mithilfe eines Filters Spezialität Schwelle standardisiert werden (zB., Huang) anstatt die variablere Standard. Sobald optimiert, sollte die Parameter eingehalten werden um zusätzliche Benutzer-Einfluss zu minimieren.
Ein Beispiel für Benutzer Variabilität ist in Abbildung 5dargestellt. Datenwerte wurden in User 1 versus User 2 erhöht und daher würde die Variabilität erhöht werden, wenn Benutzer 1 und Benutzer 2 zur Datenerhebung beigetragen. Ein Beispiel für die Unterschiede in der Benutzer 1 und Benutzer 2 binäre und skelettierten Bilder sind deutlich durch farbige Kreise (Abbildung 5). In diesem Fall waren beide Benutzer kurz ausgebildeten Studenten mit begrenzten Expertise in der Mikroglia. Regelmäßige Kontrolle und Betreuung durch einen Experten zusammen mit erhöhten Protokoll Training2 Mikroglia können Inter Benutzer Variabilität reduzieren. Obwohl hier nicht bewertet, ist Fraktalanalyse weniger anfällig für Inter Benutzer Variabilität da binäre Zellen einzeln und manuell von einem Mikrophotographie, anstatt allein auf Schnittstellenüberwachung Mikroglia Formen bestimmen isoliert sind. Alle Methoden besitzen jedoch eine gewisse Variabilität zwischen den Nutzern. Daher ein einzelner Benutzer (im Idealfall ausgebildet durch einiges an Fachwissen in Mikroglia-Zellen) sollte die Datensammlung für eine gesamte Dataset abgeschlossen.
Zusätzliche Änderungen dieses Protokolls leicht erfolgen können und hängt die Bildqualität und die Bemühungen zur Reduzierung von Lärm und Prozess-Konnektivität zu gewährleisten. Zum Beispiel, wenn Kontrast ausreicht, dann Unscharf maskieren ist nicht notwendig und kann weggelassen werden. Es ist ratsam, zu optimieren und das Protokoll für eine bestimmte Gruppe von Bildern, experimentelle Fälle und Kontrollen, vor dem Sammeln von Daten aus einem ganzen Satz abzuschließen. Zu guter Letzt zusätzliche Plugins verwendet werden, anstelle von anderen zu formulieren oder zu schärfen Bilder, die in diesem Protokoll nicht beschrieben wurden wie zu dehnen oder zu schärfen.
Vorteile dieses Protokolls sind seine universelle Verfügbarkeit und Anpassungsfähigkeit. Darüber hinaus ist die Beurteilung Zelle Verzweigung mit AnalyzeSkeleton schnell und auf eine gesamte Mikrophotographie anwendbar. Ein Vorteil der multizelle Analyseansatz ist der Fokus auf einer ganzen Region anstatt einzelner Zellen. Daher ist es möglich, die durchschnittliche Auswirkung (in Bezug auf die Endpunkte und Prozess-Länge) alle Mikroglia im Bild schnell zu beurteilen. Skelett-Analyse liefert eine Analyse mehrerer Zellen: eine Auswahl der Daten in Bezug auf die Anzahl der Zellen, die nicht von Fraktalanalyse aufgrund der erforderlichen Zeit Investitionen, einzelne Zellen von Mikrofotos isolieren abgestimmt werden. Eine Instanz, wo dies am besten geeignet sein könnte, wäre in screening-Mikroglia Morphologien in Nähe einer fokalen Verletzung. Eine Einschränkung ist, dass das ganze Feld Bildrendering Skelettmodelle IHC Mikrofotos erstellen unvollkommen im Vergleich zu der zeitaufwändiger Einzelzelle Ansatz ist. Darüber hinaus sind eine regionsanalyse nicht Umständen angemessen Mikroglia Morphologien drastisch unterschiedlich im gleichen Bereich. Zu guter Letzt ist diese Analysemethode abhängig von Zellzahl, ein Parameter, der zwischen experimentellen Bedingungen abweichen.
Fraktalanalyse erfolgt auf eine einzelne Zelle und ergänzt somit die durchschnittliche Zelle Verzweigung Datenausgabe aus dem Skelett Analyse. Obwohl viel mehr zeitaufwendig, verschiedenste morphometrische Daten diese Investition bringt. Z. B. Zelle Dichte, Span-Verhältnis und Zirkularität Daten beschreiben die Größe, die Dehnung und die Form der Zelle Gliederung, beziehungsweise. Fraktale Dimension und Lacunarity fassen die Zelle Komplexität und Heterogenität der Form, beziehungsweise. Eine ausführlichere Zusammenfassung der wie jeder Parameter berechnet wird und wie Daten interpretiert werden können finden Sie in der interaktiven manuelle16 und so detailliert betrachtet werden, in Bezug auf die spezifische Fragestellung. Das beschriebene Protokoll führt zu empfindlichen Werkzeuge, kleine Änderungen in 2D Mikroglia Morphologien zu quantifizieren, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen auftreten können. Zusätzliche morphometrische Analyse wie Solidität, Konvexität und Form Faktor16,20 wenn 3D-Formen erzeugen möglicherweise.
Protokollentwicklung und Anpassung ist kontinuierlich und nutzerorientierten. Es wurde von Fluoreszenz8 DAB/Hellfeld Bilder7 aber noch nicht zu paraffin eingebettete Gewebe ausgedehnt. Es außerdem für zusätzliche Analysen in Verbindung mit proprietärer Software wie Imaris einsetzbar. Dieses Protokoll kann auch auf eine Vielzahl von Physiologie und beschränkt sich nicht auf Mikroglia aber angewandt werden, um jede Zelle oder eines Gewebes mit bestimmten Mustern oder Formen, die mit IHC Methoden identifiziert werden können. Mit ausreichender Stichprobengröße kann schließlich eine Multivariate oder Cluster-Analyse angewendet werden, um Schichten Mikroglia nach Morphologie12,21; Dies ist sinnvolle Informationen wie Mikroglia Morphologie ein wichtiger Indikator der Mikroglia Funktionen und Reaktionen auf ihre Umgebung ist. Die Wertschätzung für die Mikroglia morphologische Vielfalt ist expandierenden und zum Verständnis wichtig Neuron-Glia-Kreislauf Interaktionen in Gesundheit und Krankheit. Wachstum in diesem Bereich wird ergänzt durch gut ausgebaute, einfach zu bedienen und reproduzierbare Protokolle zu quantifizieren und Mikroglia Morphologie mit mehreren kontinuierlichen Variablen zusammenfassen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Studie erhielten finanzielle Unterstützung von NINR (F32NR013611). Wir möchten weiter bestätigen und danken den Entwicklern von AnalyzeSkeleton(2D/3D) und FracLac (Arganda Carreras Et Al. und Karperien Et Al., beziehungsweise) ohne den hier beschriebene Analyse nicht möglich wäre.
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |