Microglia मस्तिष्क प्रतिरक्षा कोशिकाओं है कि सर्वेक्षण और सुघड़ परिवर्तन जो मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सकता है के माध्यम से बदल मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान के लिए प्रतिक्रिया कर रहे हैं । यह प्रोटोकॉल कक्ष प्रभाव, जटिलता, और आकृति जैसे मीट्रिक के अनुसार सतत डेटा के रूप में microglia आकृति विज्ञान का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक ImageJ आधारित विश्लेषण प्रोटोकॉल को रेखांकित करता है.
Microglia मस्तिष्क फ़ैगोसाइट कि मस्तिष्क homeostasis में भाग लेने और लगातार रोग, चोट, और रोग के लिए अपने पर्यावरण सर्वेक्षण कर रहे हैं । पहले प्रतिक्रिया के रूप में, microglia के लिए ंयूरॉन और glia शिथिलता को कम करने के लिए महत्वपूर्ण कार्य किया है, और इस प्रक्रिया में, वे सुघड़ परिवर्तन की एक व्यापक रेंज से गुजरना । Microglia morphologies वर्णनात्मक या वर्गीकृत किया जा सकता है, वैकल्पिक रूप से, ऐसे सेल असर, जटिलता, और आकार के रूप में मानकों के लिए एक सतत चर के रूप में quantified जा सकता है । जबकि microglia को बढ़ाता है के लिए तरीकों एकल कोशिकाओं को लागू कर रहे हैं, कुछ तकनीकों को एक पूरे photomicrograph में एकाधिक microglia के लिए लागू होते हैं । इस विधि के प्रयोजन के लिए आसानी से उपलब्ध ImageJ प्रोटोकॉल का उपयोग कर कई और एकल कोशिकाओं यों तो है । इस प्रोटोकॉल कदम और ImageJ plugins के प्रतिनिधि द्विआधारी और कंकाल छवियों में प्रतिदीप्ति और उज्ज्वल क्षेत्र photomicrographs बदलने के लिए और उंहें सॉफ्टवेयर plugins AnalyzeSkeleton का उपयोग कर विश्लेषण करने की सिफारिश की एक सारांश है (2d/ आकृति विज्ञान डेटा संग्रह के लिए । इन plugins के outputs प्रक्रिया अंतिमबिंदु, जंक्शनों, और लंबाई के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जटिलता, कोशिका आकार, और आकार वर्णनकर्ता के मामले में कक्ष आकृति विज्ञान संक्षेप । यहां वर्णित कंकाल विश्लेषण प्रोटोकॉल एक पूरे photomicrograph या ब्याज के क्षेत्र (रॉय) के भीतर एक से अधिक microglia के क्षेत्रीय विश्लेषण के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है, जबकि FracLac एक पूरक व्यक्ति सेल विश्लेषण प्रदान करता है । संयुक्त, प्रोटोकॉल एक उद्देश्य, संवेदनशील, और व्यापक आकलन उपकरण है कि विभिंन microglia स्वस्थ और घायल मस्तिष्क में मौजूद morphologies के बीच stratify के लिए इस्तेमाल किया जा सकता प्रदान करता है ।
Microglia एक तत्काल और विविध सुघड़ की प्रतिक्रिया मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान में परिवर्तन करने के लिए1 है कि हाइपर-निहितार्थ और उच्च जटिल morphologies से de-ramified और amoeboid morphologies 2 से लेकर रेंज . Microglia भी ध्रुवीकरण और रॉड के आकार का हो सकता है3। Microglia सेल असर आमतौर पर एक जटिल आकार एकाधिक प्रक्रियाओं होने के रूप में परिभाषित किया गया है और अक्सर प्रति कक्ष अंतिमबिंदु की संख्या और सेल प्रक्रियाओं की लंबाई के रूप में सूचित किया है । चूंकि microglia पतले सतत सेल-सेल क्रॉस-टॉक और vivo गतिशीलता4,5, microglia morphologies विविध सेल कार्यों और शिथिलताओं के संकेतकों के रूप में सेवा कर सकते है के माध्यम से न्यूरॉन और glial समारोह को देखते है मस्तिष्क में । इन सुघड़ परिवर्तनों की विविधता का पर्याप्त रूप से वर्णन करने के लिए और सूक्ष्म शारीरिक perturbations के साथ होने ramified कोशिकाओं के बीच मतभेदों को भेद करने के लिए एक मात्रात्मक दृष्टिकोण आवश्यक है (जैसे मिर्गी5,6 और हिलाना7) सकल चोट के अलावा (जैसे स्ट्रोक8) । आकृति विज्ञान ठहराव7,8,9,10,11,12,13,14 का एक बढ़ा उपयोग स्वास्थ्य और रोग के दौरान microglia morphologies की पूर्ण विविधता का खुलासा करेगा । वर्तमान अध्ययन ImageJ के stepwise प्रयोग के लिए आवश्यक plugins के उपयोग की जरूरत है या गैर फ्लोरोसेंट photomicrographs microglia के immunohistochemistry (आइएचसी) के बाद फिक्स्ड कुतर ऊतक में अधिग्रहीत microglia आकृति का सारांश ।
विश्लेषण तकनीकों के लिए केंद्रीय यहां वर्णित ImageJ plugins AnalyzeSkeleton (2d/15, २०१० में विकसित करने के लिए बड़े स्तन संरचनाओं यों तो, और FracLac16, २०१४ में विकसित करने के लिए एकीकृत ImageJ और भग्न विश्लेषण कर रहे है व्यक्तिगत microglia आकार को बढ़ाता है । इन plugins पूरे photomicrographs या एक photomicrograph के भीतर एक परिभाषित रॉय के एकाधिक microglia के भीतर microglia असर का एक तेजी से विश्लेषण प्रदान करते हैं । इस विश्लेषण अकेले या भग्न विश्लेषण के साथ पूरक में इस्तेमाल किया जा सकता है । एकल सेल भग्न विश्लेषण (FracLac) समय के निवेश की आवश्यकता है, लेकिन microglia जटिलता, आकार, और आकार के बारे में एकाधिक आकृति विज्ञान outputs प्रदान करता है । दोनों उपकरणों का उपयोग बेमानी नहीं है, कोशिका के प्रभाव के रूप में कोशिका जटिलता के पूरक है, और एकाधिक मापदंडों का संयोजन डेटासेट के भीतर विविध microglia morphologies के बीच अंतर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है12,17.
Microglia कोशिकाओं को पतले उनके सूक्ष्म डोमेन के भीतर शरीर क्रिया विज्ञान और विकृति को देखते है और दोनों सूक्ष्म7,14 और सकल चोट8में morphologies2 की एक विविध रेंज प्रदर्शित । ImageJ प्रोटोकॉल का उपयोग microglia आकृति विज्ञान ठहराव सभी प्रयोगशालाओं के लिए सुलभ बनाता है के रूप में मंच और plugins एक खुला स्रोत छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर हैं । जबकि वर्णित प्रोटोकॉल छवि प्रसंस्करण और इस सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित है, डेटा संग्रह, वैधता की निरंतरता, और विश्वसनीयता उत्कृष्ट आइएचसी और माइक्रोस्कोपी के साथ शुरू होता है । इस प्रोटोकॉल का उपयोग बाइनरी, कंकाल, और संपूर्ण photomicrographs और एकल कोशिकाओं की रूपरेखा निरूपण में सुधार करने के लिए किया जाता है लेकिन गरीब आइएचसी धुंधला और माइक्रोस्कोपी की जगह नहीं ले सकता जो कम कंट्रास्ट, धुंधले या विकृत छवियों में परिणाम देता है । एक अतिरिक्त विचार के रूप में, देखभाल के भंडारण के दौरान मस्तिष्क के ऊतकों को समतल करने के लिए नहीं लिया जाना चाहिए, से पहले खोदी है, जो irrevocably बदल microglia आकृति विज्ञान. अंत में, प्रत्येक प्रयोग के भीतर, microglia एक ही पैमाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से एक ही खुर्दबीन का उपयोग imaged होना चाहिए । इंस्ट्रूमेंटेशन, उद्देश्य, और सॉफ्टवेयर सूक्ष्मदर्शी जो विभिंन आकार photomicrographs में इसी तरह के उद्देश्यों के बावजूद परिणाम होगा और विस्तार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक फ्रेम के भीतर कोशिकाओं की संख्या में परिवर्तन के बीच बदलती हैं । उदाहरण के लिए, छवि अधिग्रहण पर एक 40X उद्देश्य का उपयोग कर एक Leica SPII परिणामों में दो बार कक्षों की संख्या और एक जीस ८८० का उपयोग करके प्राप्ति से कम विवरण । यह एक सेल के बजाय पूरे फ्रेम से एकत्र सेल असर डेटा के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, के रूप में यह डेटा नमूने का एक मुद्दा बन जाता है ।
सामांय में, कंकाल विश्लेषण जो पूरे photomicrograph इस्तेमाल दो कारणों के लिए एकल कोशिका भग्न विश्लेषण से पहले । एक photomicrograph में सभी कोशिकाओं के सेल असर का निर्धारण तेजी से जब एकल कोशिका भग्न विश्लेषण की तुलना में है और एक स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में माना जा सकता है अगर समय एक कारक है । इसके अलावा, कंकाल विश्लेषण के दौरान व्युत्पंन द्विआधारी छवियों भग्न विश्लेषण के लिए उपयोग किया जाता है । एक बार imaged, वहां महत्वपूर्ण कदम है कि कंकाल विश्लेषण परिणामों को प्रभावित और उपयोगकर्ता-प्रभाव परिचय हो सकता है की एक संख्या हैं । उपयोगकर्ता के बीच सबसे चर रहे है जो प्रोटोकॉल चरण चरण ४.२ (बढ़ती छवि चमक) और ४.५ चरण (थ्रेशोल्ड का निर्धारण) है । जहां संभव हो, एक इष्टतम संख्या चमक बढ़ाने के लिए (अधिकतम या 0-255 के बीच न्यूनतम स्लाइडर) निर्धारित और सभी छवियों और उपयोगकर्ताओं के लिए लगातार आयोजित किया जाता है. जहां छवि परिवर्तनशीलता महान है, उपयोगकर्ता इसके बजाय एक चमक है कि छवियों के बीच भिंन हो जाएगा चुन सकते हैं । वैकल्पिक रूप से, अगर छवियों उज्ज्वल है और इसके विपरीत उच्च है, तो बढ़ती चमक और लोप किया जा सकता है थ्रेसहोल्ड एक विशेषता दहलीज फिल्टर (उदा, हुआंग) के बजाय अधिक चर डिफ़ॉल्ट का उपयोग करके मानकीकृत किया जा सकता है । एक बार अनुकूलित, पैरामीटर के लिए पालन किया जाना चाहिए ताकि अतिरिक्त उपयोगकर्ता प्रभाव को कम करने के लिए ।
उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता का एक उदाहरण चित्रा 5में प्रस्तुत किया गया है । डेटा मान उपयोगकर्ता 1 बनाम उपयोगकर्ता 2 में बढ़ गए थे और इसलिए दोनों उपयोगकर्ता 1 और उपयोगकर्ता 2 डेटा संग्रह करने के लिए योगदान दिया, तो परिवर्तनशीलता बढ़ जाएगा । उपयोगकर्ता 1 और उपयोगकर्ता 2 बाइनरी और कंकाल छवियों में अंतर का एक उदाहरण रंगीन हलकों (चित्रा 5) द्वारा हाइलाइट किए गए हैं । इस उदाहरण में, दोनों उपयोगकर्ताओं को संक्षेप में microglia में सीमित विशेषज्ञता के साथ स्नातक छात्रों को प्रशिक्षित किया गया । नियमित निरीक्षण और वृद्धि हुई प्रोटोकॉल प्रशिक्षण के साथ एक microglia विशेषज्ञ द्वारा सलाह2 अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता को कम कर सकते हैं । हालांकि यहां मूल्यांकन नहीं, भग्न विश्लेषण कम अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता के अधीन है क्योंकि बाइनरी कोशिकाओं को मैंयुअल रूप से कर रहे है और व्यक्तिगत रूप से एक photomicrograph से अलग बजाय केवल microglia आकार निर्धारित करने के लिए थ्रेसहोल्ड पर निर्भर । हालांकि, सभी विधियों के पास उपयोगकर्ताओं के बीच कुछ परिवर्तनशीलता है । इसलिए, एक एकल उपयोगकर्ता (आदर्श, microglia कोशिकाओं में कुछ विशेषज्ञता द्वारा प्रशिक्षित) एक पूरे डेटासेट के लिए डेटा संग्रह पूरा करना चाहिए.
अतिरिक्त संशोधनों को आसानी से इस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है और छवि गुणवत्ता पर निर्भर करेगा, और शोर को कम करने और प्रक्रिया कनेक्टिविटी सुनिश्चित करने के लिए लिया गया प्रयास । उदाहरण के लिए, यदि इसके विपरीत पर्याप्त है, तो तेज मुखौटा आवश्यक नहीं है और छोड़ा जा सकता है । यह अनुकूलन और छवियों का एक विशिष्ट सेट, दोनों प्रयोगात्मक मामलों और नियंत्रण, एक पूरे सेट से डेटा इकट्ठा करने से पहले के लिए प्रोटोकॉल को अंतिम रूप देने के लिए विवेकपूर्ण है । अंत में, अतिरिक्त plugins दूसरों के स्थान पर इस्तेमाल किया जा सकता है स्पष्ट या चित्र है कि इस तरह के फैलाव या पैनापन के रूप में इस प्रोटोकॉल में वर्णित नहीं थे पैनापन ।
इस प्रोटोकॉल के लाभ अपनी सार्वभौमिक उपलब्धता और अनुकूलन क्षमता हैं । इसके अलावा, AnalyzeSkeleton का उपयोग कर सेल असर का आकलन जल्दी है और एक पूरे photomicrograph के लिए लागू है । बहु-कक्ष विश्लेषण approach का लाभ एकल कक्षों के बजाय किसी संपूर्ण क्षेत्र पर फ़ोकस होता है । इसलिए, यह जल्दी से (समापन और प्रक्रिया की लंबाई के संदर्भ में) औसत असर का आकलन करने के लिए संभव है छवि के भीतर सभी microglia की । कंकाल विश्लेषण कई कोशिकाओं का एक विश्लेषण प्रदान करता है: photomicrographs से एकल कोशिकाओं को अलग करने के लिए आवश्यक समय निवेश के कारण भग्न विश्लेषण से मिलान नहीं किया जा सकता है कि सेल संख्या के संदर्भ में एक डेटा नमूना । एक उदाहरण है जहां यह सबसे अच्छा हो सकता है उपयुक्त स्क्रीनिंग microglia morphologies में proximities में एक फोकल चोट के लिए होगा । एक सीमा पूरे क्षेत्र छवि प्रतिपादन आइएचसी photomicrographs के कंकाल मॉडल बनाने के लिए अपूर्ण है जब अधिक समय लेने वाली एकल कोशिका दृष्टिकोण की तुलना में है । इसके अलावा, एक क्षेत्र विश्लेषण जहां microglia morphologies एक ही क्षेत्र के भीतर काफी अलग है परिस्थितियों के लिए उपयुक्त नहीं है । अंत में, इस विश्लेषण विधि सेल गिनती, प्रयोगात्मक स्थितियों के बीच अलग हो सकता है कि एक पैरामीटर पर निर्भर है ।
भग्न विश्लेषण एक ही सेल पर आयोजित की जाती है और इसलिए औसत सेल असर डेटा कंकाल विश्लेषण से उत्पंन उत्पादन पूरक । हालांकि ज्यादा समय लगता है, इस निवेश morphometric डेटा की एक व्यापक रेंज पैदावार । उदाहरण के लिए, कक्ष घनत्व, अवधि अनुपात, और प्रचलन डेटा क्रमशः कक्ष बाह्यरेखा के आकार, बढ़ाव, और आकृति का वर्णन करते हैं । भग्न आयाम और lacunarity सेल जटिलता और आकार विविधता, क्रमशः संक्षेप । एक और अधिक गहराई से सारांश कैसे प्रत्येक पैरामीटर की गणना की है और कैसे डेटा की व्याख्या की जा सकती है इंटरैक्टिव मैनुअल में प्रदान की जाती है16 और इस तरह के विस्तार विशिष्ट अनुसंधान प्रश्न के संबंध में विचार किया जाना चाहिए । वर्णित प्रोटोकॉल संवेदनशील उपकरणों में परिणाम 2 डी microglia morphologies है कि शारीरिक और रोग की स्थिति में हो सकता है में छोटे परिवर्तनों को बढ़ाता है । अतिरिक्त morphometric विश्लेषण जैसे ठोसता, convexity, और फार्म फैक्टर16,20 अगर 3 डी आकार पैदा संभव हो सकता है ।
प्रोटोकॉल विकास और अनुकूलन सतत और उपयोगकर्ता संचालित है । यह प्रतिदीप्ति8 से बढ़ाया गया है ढाब/उज्ज्वल क्षेत्र छवियां7 लेकिन अभी तक नहीं आयल एंबेडेड ऊतक । इसके अलावा, यह अतिरिक्त विश्लेषण के लिए Imaris जैसे मालिकाना सॉफ्टवेयर के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल शरीर विज्ञान की एक किस्म के लिए लागू किया जा सकता है और microglia तक ही सीमित नहीं है, लेकिन किसी भी कोशिका या विशेष पैटर्न या आकार है कि आइएचसी तरीकों का उपयोग कर पहचाना जा सकता है के साथ ऊतक के लिए लागू किया जा सकता है । अंत में, पर्याप्त नमूना आकार के साथ, एक बहुभिंनरूपी या क्लस्टर विश्लेषण आकृति विज्ञान12,21के अनुसार stratify microglia के लिए लागू किया जा सकता; यह सार्थक जानकारी के रूप में microglia आकृति विज्ञान microglia कार्यों और उनके परिवेश के लिए प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण संकेतक है । microglial सुघड़ विविधता के लिए सराहना का विस्तार और महत्वपूर्ण है के लिए पूरी तरह से समझ ंयूरॉन-glia-संवहनी बातचीत के दौरान स्वास्थ्य और रोग । इस क्षेत्र में वृद्धि अच्छी तरह से विकसित की, उपयोग करने के लिए आसान है, और reproducible प्रोटोकॉल को बढ़ाता है और एकाधिक सतत चर का उपयोग microglia आकृति विज्ञान सारांश के द्वारा बढ़ाया है ।
The authors have nothing to disclose.
इस अध्ययन को NINR (F32NR013611) से वित्तीय सहायता प्राप्त हुई. हम आगे स्वीकार करते है और AnalyzeSkeleton के डेवलपर्स (2d/3d) और FracLac (Arganda-Carreras एट अल. और Karperien एट अल., क्रमशः) के बिना जो विश्लेषण वर्णित के लिए संभव नहीं होगा धंयवाद देना चाहूंगा ।
primary antibody anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | rabbit host |
Vectashield soft mount | Vector Labs | H-1000 | |
Secondary antibody | Jackson ImmunorResearch | 711-545-152 | donkey host |
4 mL glass vial | Wheaton | UX-08923-11 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151 | |
Sodium Azide (NaN3) | Sigma | S-8032 | |
glass coverslip | Fisher Scientific | 12-544-G |