تخصيب اليورانيوم وتوصيف ميكرونفيرونمينتس المناعي والمناعة غير ورم في المنشأة الأورام مورين تحت الجلد
Summary
هنا يصف لنا طريقة لفصل وإثراء مكونات من ورم المكروية محصنة وغير المتمتعين بالمناعة في أورام تحت الجلد الراسخة. يسمح هذا الأسلوب لتحليل منفصل من ارتشاح الورم المناعي والكسور الورم غير المتمتعين بالمناعة التي يمكن أن تسمح بتوصيف شامل لورم المكروية محصنة.
Abstract
قد اعترفت مؤخرا وورم المكروية المناعي (الوقت) كوسيط حرجة للاستجابة للمعالجة في الأورام الصلبة، وخاصة بالنسبة إيمونوثيرابيس. التطورات السريرية في العلاج المناعي تسليط الضوء على الحاجة إلى أساليب استنساخه دقة ودقة توصيف الورم وعن التغلغل المناعية المرتبطة بها. ورم الهضم الأنزيمي وتحليل تدفق سيتوميتريك السماح لتوصيف واسع النطاق للعديد من المجموعات الفرعية الخلايا المناعية وتعمل؛ ومع ذلك، هو غالباً ما تكون محدودة عمق التحليل fluorophore القيود المفروضة على تصميم الفريق والحاجة إلى الحصول على عينات الورم كبير لمراقبة السكان محصنة نادرة للفائدة. وبالتالي، قمنا بتطوير طريقة فعالة وعالية إنتاجية لفصل وإثراء ارتشاح الورم المناعي من مكونات الورم غير المتمتعين بالمناعة. وصف الورم الهضم والطرد المركزي القائم على كثافة الفصل تقنية يسمح توصيف منفصلة للورم والورم الكسور ارتشاح محصنة ويحافظ على استمرارية الخلوية، ويوفر بالتالي، وصف واسع للورم الدولة المناعية. تم استخدام هذا الأسلوب لتميز التغايرية محصنة المكانية واسعة النطاق في الأورام الصلبة، مما يدل على زيادة الحاجة إلى تقنيات التنميط المناعية الورم كله متسقة. وبوجه عام، يوفر هذا الأسلوب طريقة فعالة وقابلة للتكيف لتوصيف المناعية تحت الجلد من الأورام الصلبة مورين؛ على هذا النحو، يمكن استخدام هذه الأداة لأفضل تميز ميزات مناعية الأورام وفي التقييم السريري لاستراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك الرواية.
Introduction
الوقت القمعية تم الاعتراف مؤخرا باعتباره السمة مميزة للسرطان، ومن المعروف أن تلعب دوراً هاما في التنمية والتقدم، والحماية من السرطانات الصلبة الورم، فضلا عن التخفيف من تعرضها للعلاج المناعي1. الساعة تتكون من العديد من المجموعات الخلوية وتعمل، كلها توفر الحرجة من التبصر في الحالة المناعية للورم. يمكن أن تكون هذه المجموعات الفرعية المناعية طبقات كذلك في خلايا لمفاويات أو النقوي المنشأ، التي تشكل معا الغالبية من الاستجابات المناعية الفطرية وتكيفية2،3. التطورات الحديثة في مجال العلاج المناعي السرطان أظهرت أن استراتيجيات إيمونوثيرابيوتيك (أي نقطة تفتيش محصنة ضد مثبطات، مستضد تشيميريك مستقبلات الخلايا التائية، إلخ) لديها القدرة على حمل السرطان دائم التراجعات؛ ومع ذلك، تظل غير فعالة نسبيا في الأورام الصلبة السرطانات4،5. مجموعات عديدة أظهرت عقبة حاسمة أن الوقت يمكن أن تلعب على العلاج نجاحا6،7، وهكذا، تظل هناك حاجة تقييم دقيق إيمونوثيرابيس جديدة في الإعداد قبل الإكلينيكية تركز بالتحديد على ما القدرة على تعديل أو التغلب على الساعة8.
الجهود الحالية لوصف الوقت عادة ما تستخدم أما الفحص المجهري أو التدفق الخلوي جنبا إلى جنب مع جسم وسم استراتيجيات لتحديد مجموعات فرعية الخلوية المناعية وبها ميزات9،10. هاتين الاستراتيجيتين معلومات فريدة مختلفة، كما مجهرية تسمح التقدير المكاني لمجموعات فرعية الخلوية والتدفق الخلوي يوفر إنتاجية عالية والكمي الأوسع نطاقا للتغيرات الخلوية. على الرغم من التحسينات الأخيرة في فلوري immunohistochemistry متعدد تحسين نظم التصوير الطيفي، التي يمكن أن تدعم الآن المعلمات يصل إلى 7، الفريق محدودة الحجم صعوبة مستوى واسع محصنة ضد التنميط وهكذا هذا الأسلوب غالباً ما محفوظة لأكثر ركزت التحليلات. نتيجة لذلك التدفق الخلوي لا تزال واحدة من الأكثر استخداماً المناعة التنميط تقنيات. وعلى الرغم من استخدامه على نطاق واسع في توصيف الوقت، الأساليب المستخدمة لتجهيز وتلطيخ متغير تماما. استخدام البروتوكولات في أغلب الأحيان ورم الناي بإنزيم (أي، collagenases، الدناز، إلخ) وأساليب تفارق اليدوي لتحقيق تعليق خلية واحدة، تليها تلطيخ وتحليل جسم7. وعلى الرغم من مزايا كل طريقة، أظهرت العديد من الجماعات تباين واسعة النطاق التي يمكن أن يتسبب من خلال هذه التقنيات11. وهذا يجعل المقارنات عبر دراسة الأورام المكروية التنميط صعبة للغاية، حتى عند تقييم الورم مورين نفس النموذج. وعلاوة على ذلك، هذه الأساليب توفير إمكانات محدودة لتقييم الورم الخلوية والمناعية الورم التسلل المكونات بشكل مستقل، حيث يتخلل كل المكونات بعد الهضم. كمية العينة ثم يحد تلطيخ لوحة متعددة والتحليل الذي يصبح موضوعا رئيسيا عند محاولة لوصف مجموعات فرعية المناعية النادرة (أي الخاصة باستئصال ورم الخلايا التائية)12. تقنيات أكثر حداثة مثل الخلوي الشامل، أو الخلوي بوقت الرحلة (سيتوف)، يسمح بتحليل المظهرية عالية ثلاثي الأبعاد لمجموعات فرعية الخلوية مع بعض النظم التي تدعم تصميمات لوحة أكبر من المعلمات المستقلة 4213. على الرغم من قوة هائلة من التكنولوجيا سيتوف في التنميط المناعي، لا يزال محدودا بسبب المصروفات وتحليل الخبرات والحصول على المعدات. وبالإضافة إلى ذلك، العديد من البروتوكولات سيتوف يوصي بتنقية محصنة ضد مجموعات فرعية لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء14، وهكذا فإننا نقترح أن لدينا طريقة تخصيب اليورانيوم يمكن أن تستخدم المنبع سيتوف التحليل لتحسين نوعية البيانات.
هذه الوثيقة يصف لنا وجود ورم المكروية الهضم وتحليل الأسلوب الذي يشتمل على الورم المناعي التسلل الانفصال. والغرض من هذا الأسلوب هو السماح المستقلة الفائق التنميط المناعي ارتشاح الورم والورم كسور الخلوية لتوصيف أوسع نطاقا من ورم المكروية. باستخدام هذا الأسلوب، ونحن كذلك أن تبرهن على أهمية إجراء تحليل الورم كله، كما تبين أن تغايرية مهمة المناعية المكانية لنموذج الأورام صلبة تحت الجلد. عموما، هذا الأسلوب أكثر دقة واستمرار مقارنة بين عينات لأنه يثري لمجموعات فرعية الخلوية المناعية داخل الورم ويسمح للتنميط مستقلة من خلية الورم والكسور محصنة من ورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
الوقت تتألف من المكونات الخلوية المتنوعة والمعقدة والجزيئات. تشير الدلائل الأخيرة إلى أن توصيف دقيق لهذه البيئة يمكن توفير فهم أفضل للعلاج النجاح أو الفشل، وحتى تساعد في التعرف على آليات المقاومة العلاجية. على سبيل المثال، يمكن زيادة مستويات intratumoral الخلايا المثبطة للمناعة المختلفة (أ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتسلم جمن الدعم المالي المقدم من المعهد الوطني للعامة الطبية العلوم (T32GM088129) والمعهد الوطني لطب الأسنان والجمجمة البحوث (F31DE026682) كل من “المعاهد الوطنية للصحة”. المحتوى هي المسؤولة الوحيدة عن المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية “المعاهد الوطنية للصحة”. بتأييد هذا المشروع أيضا بالخلوي والخلية الأساسية الفرز في “كلية بايلور للطب” بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة (P30 AI036211 و P30 CA125123 و S10 RR024574) ومساعدة الخبراء من جويل م. سيديرستروم.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
