Zenginleştirme ve kurulan subkutan fare tümör tümör bağışıklık ve Non-immün Microenvironments karakterizasyonu
Summary
Burada ayırmak ve kurulan subkutan tümörler tümör bağışıklık ve non-immün microenvironment bileşenlerinin zenginleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik tümör bağışıklık sızmak ve tümör bağışıklık microenvironment kapsamlı karakterizasyonu izin verebilir non-immün tümör kesirler ayrı analiz için sağlar.
Abstract
Tümör bağışıklık microenvironment (zaman) son zamanlarda özellikle immunotherapies için solid tümör tedavi yanıtının kritik bir aracı olarak kabul edilmiştir. Klinik gelişmeler son immünoterapi tümör ve onun ilişkili bağışıklık infiltrat doğru ve iyice ayırdetmek tekrarlanabilir yöntemleri ihtiyacını vurgulamak. Tümör enzimatik sindirim ve akış sitometrik çözümlemesi çok sayıda bağışıklık hücre alt kümeleri ve fenotipleri geniş karakterizasyonu izin; Ancak, derinlik analizi kez panel tasarım ve büyük tümör örnekleri elde etmek için gereken nadir bağışıklık nüfus ilgi gözlemlemek için fluorophore kısıtlamalar ile sınırlıdır. Böylece, ayıran ve tümör bağışıklık infiltrat non-immün tümör bileşenlerinden zenginleştirici bir etkili ve yüksek üretilen iş yöntem geliştirdik. Açıklanan tümör sindirim ve santrifüj yoğunluğu tabanlı ayırma tekniği tümör ve tümör ayrı karakterizasyonu bağışıklık infiltrat kesirler ve hücresel canlılığı korur ve böylece, tümörün geniş bir karakterizasyonu sağlar immünolojik durumu. Bu yöntemi daha da tutarlı bütün tümör immünolojik profil oluşturma teknikleri gerek gösteren geniş kayma bağışıklık heterojenite solid tümör olarak karakterize etmek için kullanıldı. Genel olarak, bu yöntem bir etkili ve uyarlanabilir teknik subkutan solid fare tümör immünolojik karakterizasyonu için sağlar; Bu nedenle, bu aracı tumoral immünolojik özellikleri daha iyi tanımlamak için kullanılabilir ve Roman immunotherapeutic stratejileri preklinik değerlendirilmesi.
Introduction
Baskılayıcı zaman son zamanlarda kanser damgasını kabul edilmiştir ve gelişme, ilerleme ve solid tümör kanser koruma önemli bir rol oynar gibi onların duyarlılık immünoterapi1azaltmak bilinmektedir. ZAMAN çok sayıda hücresel alt kümeleri ve fenotipleri, tüm bunların içine tümör immünolojik durumunu kritik hakkında bilgi sağlayan oluşur. İmmünolojik şu alt kümeleri daha fazla birlikte doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı2,3çoğunluğu oluşturan hücrelere lenfosit veya miyeloid kökenli, tabakalı. İmmunotherapeutic stratejileri (Yani, bağışıklık denetim noktası inhibitörleri, chimeric antijen reseptör T-hücreleri, vb) dayanıklı kanser neden potansiyeline sahip kanserli hastalarda alanındaki son gelişmeler göstermiştir regresyonlar; Ancak, bunlar solid tümör kanser4,5‘ te görece etkisiz kalır. Çok sayıda gruplar en kritik engel kez tedavi başarı6,7üzerinde oynayabilir ve böylece, yeni immunotherapies özellikle odaklanarak önceden klinik ortamda doğru değerlendirmek gerek kalır göstermiştir onların yetenek modüle veya saat8üstesinden gelmek için.
ZAMAN genellikle karakterize etmek için şimdiki çabalar ya mikroskobu kullanmak veya akış sitometresi ile birlikte hücresel bağışıklık alt kümeleri ve onların özellikleri9,10tanımlamak için stratejiler etiketleme antikor. Bu iki stratejileri mikroskobu kayma takdir hücresel alt kümeleri ve yüksek işlem hacmi ve hücresel değişikliklerin daha geniş miktar akış sitometresi sağlar gibi benzersiz olarak farklı bilgiler sağlamanız. Şimdi 7 parametreleri destekler, spektral görüntüleme sistemleri en iyi duruma getirme floresan multiplex immünhistokimya son gelişmeler rağmen sınırlı panel boyutu geniş düzeyde bağışıklık profil oluşturma zor yapar ve bu nedenle bu teknik kez daha fazla bilgi için saklıdır analizleri duruldu. Sonuç olarak, akış sitometresi teknikleri profil oluşturma en çok kullanılan bağışıklık biri olmaya devam etmektedir. ZAMAN karakterizasyonu rağmen yaygın kullanımı, işleme ve boyama için kullanılan yöntemleri oldukça değişkendir. En sık iletişim kurallarını kullanmak bir tümör enzim dissociating (Yani, collagenases, DNaz, vb) ve tek hücreli süspansiyonlar, elde etmek için el ile ayrılma yöntemleri takip antikor boyama ve analiz7tarafından. Her yöntemin faydaları rağmen çok sayıda gruplar bu teknikleri11indüklenen geniş değişkenlik göstermiştir. Bu tümör microenvironment profil oluşturma çapraz-çalışma karşılaştırmalar geçici son derece zor, hatta aynı fare tümör modeli değerlendirirken. Ayrıca, sınırlı potansiyel tümör hücresel değerlendirmek için bu yöntemleri sağlar ve tümör bağışıklık sızmak bileşenleri bağımsız olarak, her iki bileşenin sindirim sonra serpiştirilmiş olan bu yana. Örnek miktar sonra sınırlar paneli çoklu boyama ve analiz, nadir immünolojik alt kümeleri karakterize etmek çalışırken büyük bir sorun olur (Yani, tümör özel T-hücreleri)12. Kitle sitometresi veya sitometresi saat uçuş (CyTOF), tarafından gibi daha yeni teknikler 42 bağımsız parametreleri13den büyük masası tasarımları destekleyen bazı sistemleri ile hücresel alt kümeleri yüksek boyutlu fenotipik analizi sağlar. CyTOF teknoloji bağışıklık profil oluşturma içinde muazzam güç rağmen bu gider, analiz uzmanlık ve ekipman erişim nedeniyle sınırlı kalır. Buna ek olarak, birçok CyTOF protokolleri sinyal-gürültü oranı14geliştirmek için bağışıklık alt kümeleri arıtma tavsiye ve böylece bizim zenginleştirme yöntemi kullanılan olabilir öneririz veri kalitesini artırmak için CyTOF analiz ters yönde.
Burada bir tümör microenvironment sindirim ve tümör bağışıklık birleştirmek yöntemi sızmak ayırma Analizi açıklanmaktadır. Bu yöntemin amacı bağımsız yüksek üretilen iş tümör bağışıklık sızmak ve tümör hücresel bölümler tümör microenvironment daha geniş karakterizasyonu için profil oluşturma izin vermektir. Subkutan solid tümör manken önemli kayma immünolojik heterojenite için bulundu gibi bu yöntemi kullanarak, biz daha fazla bütün tümör çözümlemesini önemini göstermektedir. Bu tümör içinde hücresel bağışıklık alt kümeleri için zenginleştirir ve bağımsız bir tümör bağışıklık kesirler ve tümör hücre profil oluşturma için sağlar çünkü genel olarak, bu yöntem daha doğru ve tutarlı bir şekilde örnekleri arasında karşılaştırabilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZAMAN çeşitli ve karmaşık hücresel bileşenleri ve molekülleri oluşmaktadır. Son kanıtlar bu ortamda doğru karakterizasyonu daha iyi anlaşılmasını tedavi başarı veya başarısızlık sağlayabilir ve hatta tedavi direnç mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir gösteriyor. Örneğin, çeşitli immünsüpresif hücreleri (Yani, MDSCs, düzenleyici T hücreleri, vs) intratumoral düzeylerini artırma efektör bağışıklık yanıtı azaltmak ve immunotherapeutic etkileri iptal et…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü (T32GM088129) ve Ulusal Enstitüsü Diş ve fasiyal araştırma (F31DE026682) mali desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri her ikisi de kabul eder. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmiyor. Bu proje aynı zamanda NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 ve S10 RR024574) ve Joel M. Sederstrom uzman yardımı fon ile Sitometresi ve hücre sıralama özünde Baylor Tıp Fakültesi tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
