Berikelse og karakterisering av svulst immun og ikke-immune Microenvironments i etablerte subkutan Murine svulster
Summary
Her beskriver vi en metode for å skille og berike komponenter av svulst immun og ikke-immune microenvironment i etablerte subkutan svulster. Denne teknikken tillater for egen analyse av tumor immun infiltrere og ikke-immune svulst fraksjoner som kan tillate omfattende karakteristikk av svulst immun microenvironment.
Abstract
Svulst immun microenvironment (tid) har nylig blitt anerkjent som en kritisk megler av behandlingsrespons i solide svulster, spesielt for immunotherapies. Nylige klinisk fremskritt innen immunterapi fremheve behovet for reproduserbar metoder å nøyaktig og grundig karakterisere svulsten og dens tilknyttede immun infiltrere. Svulst enzymatisk fordøyelsen og flyt cytometric analyse tillate bred karakterisering av mange immun celle undergrupper og fenotyper; men er dyp analyse ofte begrenset av fluorophore restriksjoner på panelet design og behovet for å skaffe stor svulst prøver å observere sjeldne immun bestander av interesse. Derfor har vi utviklet en effektiv og høy gjennomstrømning metode for separasjon og berikende svulst immun infiltrere fra ikke-immune svulst komponentene. Beskrevet svulst fordøyelsen og sentrifugal tetthet-baserte separasjon teknikken tillater egen karakterisering av svulsten og tumor immun infiltrere fraksjoner og beholder mobilnettet levedyktighet, og dermed gir bred karakteristikk av svulsten immunologiske tilstand. Denne metoden ble brukt til å beskrive den omfattende romlige immune heterogenitet i solide svulster, som ytterligere viser behovet for konsekvent hele svulst immunologic profilering teknikker. Total, denne metoden gir en effektiv og tilpasningsdyktig teknikk for immunologiske karakterisering av subkutan solide murine svulster; som sådan, dette verktøyet kan brukes til å bedre karakteriserer tumoral immunologic funksjonene og i preklinisk evalueringen av romanen immunterapeutisk strategier.
Introduction
Undertrykkende tiden har nylig blitt anerkjent som et kjennetegn på kreft, og er kjent for å spille en betydelig rolle i utviklingen, progresjon og beskyttelse av solid tumor kreft samt redusere deres mottakelighet for immunterapi1. TIDEN er sammensatt av mange mobilnettet delsett og fenotyper, alle gi viktig innsikt i immunologic staten av svulsten. Disse immunologic delsett kan være ytterligere lagdelt i celler av lymfocytt eller myelogen opprinnelse, som til sammen utgjør flertallet av det medfødte og adaptive immunreaksjoner2,3. Nylige fremskritt innen kreft immunterapi har vist at immunterapeutisk strategier (dvs. immun checkpoint hemmere, chimeric antigen reseptor T-celler, etc.) har potensial til å indusere holdbar kreft regresjoner; men forblir de relativt ineffektiv i solid tumor kreft4,5. Flere grupper har vist det avgjørende hinderet at tiden kan spille på behandling suksess6,7, og derfor det fortsatt behov for å vurdere nøyaktig nye immunotherapies i pre-klinisk innstillingen spesielt fokusere på deres muligheten til å modulate eller overvinne tid8.
Dagens innsats å karakterisere tiden vanligvis benytte enten mikroskopi eller flow cytometri sammen med antistoff merking strategier for å identifisere immun mobilnettet delsett og deres funksjoner9,10. Disse to strategier gir unikt forskjellig informasjon, som mikroskopi tillater romlige styrking av mobilnettet delsett og flowcytometri gir høy gjennomstrømning og bredere kvantifisering av mobilnettet endringer. Til tross for de siste forbedringene i fluorescerende multiplex immunohistochemistry optimalisere spectral imaging-systemer, som nå kan støtte opptil 7 parametere, begrenset panelet størrelse gjør bredt nivå immun profilering vanskelig og dermed denne teknikken er ofte forbeholdt mer fokusert analyser. Resultatet fortsatt flowcytometri en av de mest brukte immunt profilering teknikker. Til tross for utbredt bruk i tid karakterisering er metodene som brukes for behandling og flekker ganske variable. Oftest protokoller utnytte en svulst dissociating enzym (dvs. collagenases, DNase, etc.) og manuell dissosiasjon metoder å oppnå encellede suspensjoner, etterfulgt av antistoff flekker og analyse7. Til tross for fordelene med hver metode, har mange grupper vist omfattende variasjon som kan bli overtalt til disse teknikker11. Dette gjør kryss-studie sammenligninger av svulst microenvironment profilering svært vanskelig, selv når vurdere samme murine svulst modell. Videre disse metodene gir begrenset mulighet til å vurdere svulst mobilnettet og svulst immun infiltrere komponenter uavhengig, siden begge komponentene er utblandet etter fordøyelsen. Eksempel antallet deretter begrenser flere panelet flekker og analyse, som blir et stort problem når du prøver å beskrive sjeldne immunologic delsett (dvs. svulst-spesifikke T-celler)12. Nyere teknikker som masse cytometri, eller cytometri av tiden for flygningen (CyTOF), lar høy-dimensjonale fenotypiske analyse av mobilnettet delsett med noen systemer støtter panel design på mer enn 42 uavhengig parametere13. Til tross for den enorme kraften av CyTOF teknologi i immun profilering, fortsatt det begrenset på grunn av bekostning, analyse kompetanse og tilgang til utstyret. I tillegg mange CyTOF protokoller anbefale rensing av immun delsett å forbedre signal-til-støy-forhold14, og derfor foreslår vi at vår berikelse metoden kan brukes over CyTOF analyse for å bedre datakvaliteten.
Her beskriver vi en svulst microenvironment fordøyelsen og analyse metode som bruker svulst immun infiltrere separasjon. Formålet med denne metoden er at uavhengige høy gjennomstrømming profilering av svulst immun infiltrere og svulst mobilnettet brøker for bredere karakteristikk av svulst microenvironment. Bruker denne metoden, demonstrere vi ytterligere viktigheten av hele svulst analyse, som en subcutaneous solid tumor modell ble funnet for å ha betydelig romlige immunologic heterogenitet. Total, denne metoden kan mer nøyaktig og konsekvent sammenligne mellom prøvene fordi det beriker for immun mobilnettet delsett i svulst og gir uavhengige profilering av svulst celle og immun fraksjoner av en svulst.
Protocol
Representative Results
Discussion
TIDEN består av varierte og komplekse cellulære komponenter og molekyler. Nyere bevis antyder at nøyaktig karakteristikk av dette miljøet kan gi en bedre forståelse av suksess eller fiasko, og kan også hjelpe identifisere mekanismer for terapeutisk motstand. For eksempel kan øker intratumoral nivåer av ulike suppressive celler (dvs. MDSCs, regulatoriske T-celler, etc.) redusere effektor immunreaksjoner og oppheve immunterapeutisk effekter. På den annen side, kan økende intratumoral tilstedevæ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN erkjenner økonomisk støtte fra National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) og National Institute for Dental & Craniofacial forskning (F31DE026682) begge National Institutes of Health. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. Dette prosjektet ble også støttet av cytometri og celle sortering kjernen ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (P30 AI036211 P30 CA125123 og S10 RR024574) og eksperthjelp av Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
