העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית
Summary
כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.
Abstract
הגידול חסין microenvironment (זמן) לאחרונה הוכר כמתווך קריטי של תגובה לטיפול בגידולים מוצקים, במיוחד עבור immunotherapies. התפתחויות אחרונות קליניים חיסוני מדגישות את הצורך שיטות לשחזור לאפיין במדויק וביסודיות הגידול, שלה לחדור המערכת החיסונית המשויך. עיכול אנזימטי הגידול וניתוח cytometric זרימה מאפשרים אפיון רחבה של קבוצות משנה תא החיסון הרבות פנוטיפים; עם זאת, וניתוח מעמיק לעיתים קרובות מוגבל fluorophore הגבלות על לוח עיצוב את הצורך לרכוש דגימות הגידול גדול להתבונן אוכלוסיות החיסון נדירים של ריבית. לכן, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הפרדת ומעשירה הגידול לחדור המערכת החיסונית של הרכיבים הלא-החיסון הגידול. הגידול שתואר לעיכול, הפרדה צנטריפוגלית המבוסס על צפיפות הטכניקה מאפשרת אפיון נפרדים של הגידול, הגידול לחדור המערכת החיסונית שברים המשמרת את הכדאיות הסלולר ואני לפיכך, מספק אפיון רחבה של הגידול מצב אוטואימונית. בשיטה זו נעשה שימוש כדי לאפיין את מקיף המרחבי המערכת החיסונית הטרוגניות בגידולים מוצקים, אשר בהמשך מדגים את הצורך טכניקות פרופיל אוטואימונית עקבי כל הגידול. בסך הכל, שיטה זו מספקת טכניקה יעילה וישימה עבור אפיון אוטואימונית תת עורית מאתר גידולים מוצקים; ככזה, כלי זה יכול לשמש כדי לאפיין טוב יותר את התכונות tumoral אוטואימונית, בהערכה פרה של הרומן אסטרטגיות immunotherapeutic.
Introduction
הזמן מדכאים לאחרונה הוכר סימן היכר של סרטן, וידוע לשחק תפקיד משמעותי התפתחות, התקדמות והגנה של גידולים מוצקים סרטן, כמו גם להמתיק את הרגישות חיסוני1. הזמן מורכב של מספר קבוצות משנה הסלולר של הפנוטיפים, אשר כולם לספק תובנות קריטי למדינה אוטואימונית של הגידול. אלה קבוצות משנה אוטואימונית יכול להיות מרובדת יותר לתוך תאים של לימפוציטים או מיאלואידית המוצא, אשר יחד מהווים את הרוב של תגובות חיסוניות מולדת, גמישים,2,3. ההתקדמות בתחום חיסוני סרטן הראו כי אסטרטגיות immunotherapeutic (קרי, מעכבי המערכת החיסונית במחסום, chimeric אנטיגן קולטן תאי-T, וכו ‘) יש פוטנציאל לגרום סרטן עמיד regressions; עם זאת, הם נשארים יעיל יחסית גידולים מוצקים-סרטן-4,–5. קבוצות רבות הראו המשוכה קריטי כי הזמן יכול לשחק על טיפול הצלחה6,7, לפיכך, נותר צורך להעריך במדויק את immunotherapies החדש בהגדרת קליניים במיוחד התמקדות שלהם היכולת לווסת או להתגבר על הזמן8.
המאמצים הנוכחיים כדי לאפיין את הזמן בדרך כלל לנצל או מיקרוסקופ או לזרום cytometry יחד עם נוגדן תיוג אסטרטגיות כדי לזהות קבוצות משנה התאית החיסונית שלהם תכונות9,10. אלה שתי אסטרטגיות לספק מידע שונים ייחודי, כמו מיקרוסקופ מאפשר הערכה המרחבי של קבוצות משנה הסלולר cytometry זרימה מספק תפוקה גבוהה, כימות רחבה של שינויים סלולריים. למרות השיפורים בפלורסנט אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס אופטימיזציה של מערכות הדמיה ספקטרלי, אשר כעת יכול לתמוך עד 7 פרמטרים, גודל לוח מוגבל מקשה רחבה רמת החיסון פרופיל, ובכך טכניקה זו היא לעתים קרובות שמורות יותר ממוקד ניתוחים. כתוצאה מכך, cytometry זרימה נשאר באחת החיסון הנפוצה ביותר. פרופילים טכניקות. למרות השימוש הנרחב שלה באפיון זמן, השיטות המשמש לעיבוד של צביעת הן משתנה מאוד. בדרך כלל פרוטוקולים לנצל את גידול בריא אנזים (קרי, collagenases, DNase, וכו) שיטות דיסוציאציה ידנית כדי להשיג את המתלים מתא בודד, ואחריו נוגדן מכתים וניתוח7. למרות היתרונות של כל אחת מהשיטות, קבוצות רבות הראו ההשתנות נרחב זה יכול להיגרם באמצעות טכניקות אלה11. זה עושה השוואות קרוס-מחקר של גידול microenvironment פרופיל קשה מאוד, גם כאשר הערכת המודל מאתר הגידול באותו. יתר על כן, שיטות אלה מספקים פוטנציאל מוגבל כדי להעריך את תאי הגידול, הגידול החיסון לחדור רכיבים באופן עצמאי, שכן שני הרכיבים הם וביניהם לאחר עיכול. כמות הדגימה מגביל ואז רב הפאנל מכתים וניתוח, אשר הופך להיות נושא מרכזי כאשר מנסים לאפיין קבוצות משנה אוטואימונית נדירה (קרי, הגידול הספציפי תאי-T)12. טכניקות מאוחרים יותר כגון cytometry המונית או cytometry מאת שעת הטיסה (CyTOF), מאפשרים ניתוח פנוטיפי גבוהה-ממדי הסלולר קבוצות משנה עם כמה מערכות תמיכה לוח עיצובים של יותר מ 42 פרמטרים עצמאיים13. למרות הכוח העצום של טכנולוגיה CyTOF פרופיל החיסונית, נותר מוגבל בשל ההוצאות, ניתוח מומחיות, גישה לציוד. בנוסף, פרוטוקולים CyTOF רבים ממליצים על טיהור של קבוצות משנה המערכת החיסונית כדי לשפר את יחס אות לרעש14, ועל כן אנו מציעים כי שיטת העשרה שלנו יכול לשמש הזרם של CyTOF ניתוח לשיפור איכות הנתונים.
במסמך זה אנו מתארים של גידול microenvironment לעיכול, ניתוח בשיטה המשלבת הגידול החיסון לחדור ההפרדה. מטרת שיטה זו היא לאפשר תפוקה גבוהה עצמאית פרופיל של הגידול לחדור המערכת החיסונית ואת הגידול שברים הסלולר עבור אפיון רחבה יותר של microenvironment הגידול. באמצעות שיטה זו, רחוק נדגים את החשיבות של ביצוע ניתוח כל הגידול, כמו דוגמנית גידולים מוצקים תת עורית נמצאה משמעותי הטרוגניות אוטואימונית מרחבית. בסך הכל, שיטה זו באפשרותך יותר מדויק ועקבי להשוות בין מדגמים כי זה מעשיר את מערכת החיסון התאית קבוצות משנה בתוך הגידול ומאפשר בניית פרופיל עצמאית של גידול תאים ושברים המערכת החיסונית של הגידול.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזמן מורכב מרכיבי התא מגוונות ומורכבות ומולקולות. ממצאים אחרונים מעידים כי אפיון מדויק של סביבה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של הטיפול הצלחה או כישלון, יכול אפילו לעזור לזהות את מנגנוני ההתנגדות טיפולית. לדוגמה, הגדלת רמות intratumoral של תאים שונים לדיכוי המערכת החיסונית (קרי, MDSCs, תאי T רגו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN מאשר תמיכה כספית מ הלאומית המכון של כללי למדעי הרפואה (T32GM088129), נבחרת המכון של שיניים ותחקיר ואסטתיים (F31DE026682) של מכוני הבריאות הלאומיים. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים. פרויקט זה גם נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (P30 AI036211 P30 CA125123, S10 RR024574) ואת הסיוע מומחה של ג’ואל מ Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
