Обогащение и характеристика опухоли иммунной и неиммунизированных микросреды в установленных подкожной мышиных опухоли
Summary
Здесь мы описываем метод для разделения и обогатить компоненты иммунной и неиммунизированных микроокружения опухоли в установленных подкожной опухоли. Эта техника позволяет для отдельного анализа иммунной инфильтрата опухоли и опухоли неиммунизированных фракций, допускающие всеобъемлющей характеристика иммунной микроокружения опухоли.
Abstract
Иммунных микроокружения опухоли (время) недавно был признан критическим посредника лечения реакции в солидных опухолей, особенно для immunotherapies. Последние клинические достижения в иммунотерапии подчеркивают необходимость для воспроизводимых методы точно и тщательно характеризовать опухоли и ее ассоциированных иммунной инфильтрата. Опухоль ферментативного пищеварения и анализ потока гранулярных позволяют широкий характеристика многочисленных подмножеств иммунных клеток и фенотипы; Однако глубина анализа часто ограничивается Флюорофор ограничений на дизайн панели и необходимость приобретения большой опухоли образцы наблюдать редких иммунитета населения интерес. Таким образом мы разработали метод эффективной и высокой пропускной способности для разделения и обогащение иммунной инфильтрата опухоль от компонентов неиммунизированных опухоли. Описанные опухоли пищеварение и центробежной сепарации на основе плотности техника позволяет отдельные характеристики опухоли и опухоли иммунной инфильтрата фракций и сохраняет клеточной жизнеспособности и таким образом, обеспечивает широкую характеристику опухоли Иммунологические состояние. Этот метод был использован для характеристики обширные пространственные иммунной гетерогенность в солидных опухолей, который еще раз демонстрирует необходимость последовательного всей опухоли иммунологические методы профилирования. В целом этот метод обеспечивает метод эффективной и гибкой для иммунологической характеристики подкожной мышиных солидных опухолей; Таким образом, этот инструмент может использоваться для лучше характеризуют опухолевой иммунологические особенности и в доклинической оценке новых иммунотерапевтических стратегий.
Introduction
ЭТИМ супрессивной недавно было признано в качестве отличительной чертой рака и известен играть значительную роль в разработке, прогрессии и защита твердых опухоли рака, а также уменьшить их подверженность иммунотерапия1. ВРЕМЯ состоит из многочисленных клеточных подмножеств и фенотипы, все из которых обеспечивают критический взгляд в состояние иммунологической опухоли. Эти иммунологические подмножества может быть далее разбиты на клетки лимфоцита или миелоидной происхождения, которые вместе составляют большинство врожденного и адаптивного иммунного ответа2,3. Последние достижения в области рака иммунотерапия продемонстрировали, что иммунотерапевтических стратегии (т.е., иммунных КПП ингибиторы, химерных антигена рецепторов Т-клетки и т.д.) имеют потенциал, чтобы побудить прочный рака регрессии; Однако они по-прежнему относительно неэффективными в твердые опухоли рака4,5. Многочисленные группы показали критическое препятствие, что время может играть на успех лечения6,7, и таким образом, сохраняется необходимость точно оценить новые immunotherapies в параметре доклинические, уделяя особое внимание их возможность модулировать или преодолеть время8.
Нынешние попытки характеризовать время обычно используют либо микроскопии или проточная цитометрия наряду с антитела обозначая стратегии выявления клеточных иммунных подмножеств и их особенности9,10. Эти две стратегии обеспечивают уникально различную информацию, как микроскопии позволяет пространственных признательность сотовой подмножеств и проточной цитометрии обеспечивает высокую пропускную способность и более широкой количественная оценка клеточных изменений. Несмотря на недавние улучшения в флуоресцентные мультиплекс иммуногистохимии, оптимизации спектральных тепловизионных систем, которые теперь может поддерживать до 7 параметры, ограниченной группы размер затрудняет широкий уровень иммунной профилирования и таким образом эта техника часто зарезервировано для более сосредоточены анализы. В результате проточной цитометрии остается одним из наиболее широко используемых иммунной, методы профилирования. Несмотря на широкое использование в характеристике времени методы, используемые для обработки и окраски являются довольно переменной. Чаще всего протоколы используют опухоль отделения фермента (то есть, коллагеназы, DNase, и т.д.) и ручной диссоциации методы для достижения одной ячейки суспензий, следуют антитело пятная и анализ7. Несмотря на преимущества каждого метода многочисленные группы показали большой изменчивости, который может быть вызван через эти методы11. Это крайне затрудняет сопоставление кросс исследование профилирования микроокружения опухоли, даже при оценке той же модели мышиных опухоли. Кроме того эти методы предоставляют ограниченный потенциал для оценки опухоли сотовой и опухоли иммунной проникновения компонентов независимо друг от друга, поскольку оба компонента перемежаются после переваривания. Количество образцов затем ограничивает мультипанельные окрашивание и анализа, который становится серьезной проблемой при попытке характеризовать редкие иммунологические подмножеств (то есть, опухоль – специфичные Т-клетки)12. Более последние методы массового цитометрии, или цитометрии на время полета (CyTOF), позволяют высокой мерного фенотипического анализа сотовой подмножеств с некоторых систем, поддерживающих конструкций группа более чем 42 независимых параметров13. Несмотря на огромную мощь CyTOF технологии в иммунной профилирование он остается ограниченным из-за расходов, анализ опыта и доступ к оборудованию. Кроме того, многие протоколы CyTOF рекомендуем очистки иммунных подмножеств для улучшения соотношения сигнал шум14, и поэтому мы предлагаем, что наш метод обогащения могут быть использованы вверх по течению от CyTOF анализа для повышения качества данных.
Здесь мы описываем пищеварение микроокружения опухоли и анализа, метод, который включает в себя опухоли иммунной проникновения разделения. Цель данного метода должна позволить независимым высок объём профилирование иммунной инфильтрата опухоли и опухоли сотовой фракций для широкого характеристика микроокружения опухоли. С помощью этого метода, мы еще больше продемонстрировать важность проведения анализа всей опухоли, как модель подкожной твердых опухолей было установлено значительное пространственная неоднородность иммунологические. В целом этот метод можно более точно и последовательно сравнить между выборками потому что оно обогащает иммунной сотовой подмножеств внутри опухоли и позволяет для независимого профилирования опухолевых клеток и иммунных фракций опухоли.
Protocol
Representative Results
Discussion
ВРЕМЯ состоит из разнообразных и сложных клеточных компонентов и молекул. Последние данные свидетельствуют о том, что точная характеристика этой среды может обеспечить более глубокого понимания лечения успеха или неудачи и может даже помочь определить механизмы терапевтического соп…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN признает финансовую поддержку от национального института Генеральной медицинских наук (T32GM088129) и Национального Института стоматологии и челюстно-лицевой исследований (F31DE026682), оба из национальных институтов здравоохранения. Содержание является исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения национальных институтов здоровья. Этот проект был поддержан также цитометрии и сортировка сердечник клетки в колледж Бейлор с финансирования из низ (P30 AI036211 Р30 CA125123 и S10 RR024574) и экспертной помощи Джоэл м. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
