Anrikning och karakterisering av de tumör immun och icke-immun mikromiljö i etablerade subkutan murina tumörer
Summary
Här beskriver vi en metod för att separera och berika komponenter i den tumör immun och icke-immun närmiljön i etablerade subkutana tumörer. Denna teknik möjliggör separat analys av tumören immun infiltrera och icke-immun tumör fraktioner som kan möjliggöra omfattande karakterisering av den tumör immun mikromiljö.
Abstract
Den tumör immun närmiljön (tid) har nyligen erkänts som en kritisk mediator av behandlingssvar i solida tumörer, särskilt för immunterapi. Senaste kliniska framsteg inom immunterapi belysa behovet av reproducerbara metoder att korrekt och noggrant karakterisera tumören och dess associerade immun infiltrera. Tumör enzymatisk nedbrytning och flöde flödescytometrisk analys tillåter bred karakterisering av talrika immunceller underdelar och fenotyper; dock begränsas ofta djup analys av fluorophore restriktioner på panel design och behovet av att förvärva stora tumörprover för att observera sällsynta immun populationer av intresse. Därför har vi utvecklat en effektiv och hög genomströmning metod för separering och berika den tumör immun infiltrera från icke-immun tumör komponenter. Beskrivna tumör matsmältningen och centrifugal densitet-baserade separation teknik tillåter separat karakterisering av tumör och tumör immun infiltrera fraktioner och bevarar cellulära livskraft, och ger således en bred karakterisering av tumören immunologiska tillstånd. Denna metod användes för att karakterisera den omfattande rumsliga immun heterogenitet i solida tumörer, vilket ytterligare visar behovet av konsekventa hela tumören immunologisk profilering tekniker. Sammantaget ger denna metod en effektiv och anpassningsbar teknik för immunologisk karakterisering av subkutan solid murina tumörer; som sådan, detta verktyg kan användas för att bättre karaktärisera de tumoral immunologiska funktionerna och i prekliniska utvärderingen av romanen immunoterapeutisk strategier.
Introduction
Suppressiv tiden har nyligen erkänts som ett kännetecken för cancer, och är känd för att spela en betydande roll i utveckling, progression och skydd av solid tumör cancer samt mildra deras känslighet för immunterapi1. TIDEN består av många cellulära underdelar och fenotyper, alla ger kritisk insikt i det immunologiska tillståndet av tumören. Dessa immunologisk undergrupper kan vara ytterligare stratifierat i celler av lymfocyter eller myeloisk ursprung, som tillsammans utgör majoriteten av de medfödda och adaptiva immunsvaret2,3. Senaste framstegen inom området för immunterapi mot cancer har visat att immunoterapeutisk strategier (dvs immun checkpoint-hämmare, chimär antigen receptorn T-celler, etc.) har potential att inducera tålig cancer regressioner; de är dock fortfarande relativt ineffektiva i solid tumör cancer4,5. Många grupper har visat det avgörande hindret att tiden kan spela på behandling framgång6,7, och således finns det fortfarande ett behov av att noggrant utvärdera nya immunterapier i inställningen prekliniska specifikt fokusera på sin förmåga att modulera eller övervinna den tid8.
Aktuella insatser att karakterisera tiden vanligtvis använda antingen mikroskopi eller flödescytometri tillsammans med antikropp märkning strategier för att identifiera immun cellulära underdelar och deras funktioner9,10. Dessa två strategier ge unikt olika information, som mikroskopi kan fysisk apprecieringen av cellulära delmängder och flödescytometri ger hög genomströmning och bredare kvantifiering av cellulära förändringar. Trots de senaste förbättringarna i fluorescerande multiplex immunohistokemi optimera spektrala bildsystem, som nu kan stödja upp till 7 parametrar, begränsad panel storlek försvårar bred nivå immun profilering och således denna teknik är ofta reserverade för mer fokuserade analyser. Som ett resultat, förblir flödescytometri en av de mest använda immun profilering tekniker. Trots dess utbredda användning i tid karakterisering är metoderna som används för beredning och färgning ganska variabel. Oftast protokoll utnyttja en tumör separera enzym (dvs kollagenaser, DNase, etc.) och manuell dissociation metoder att uppnå encelliga suspensioner, följt av antikropp färgning och analys7. Trots fördelarna med varje metod, har talrika grupper visat den omfattande variationen som kan induceras genom dessa tekniker11. Detta gör cross-studien jämförelser av tumör mikromiljö profilering extremt svårt, även vid bedömningen av samma modell som murina tumör. Dessutom dessa metoder ger begränsade möjligheter att bedöma tumör cellulära och tumör immun infiltrera komponenter självständigt, eftersom båda komponenterna varvas efter matsmältningen. Prov kvantitet sedan begränsar multi-panel färgning och analys, som blir en viktig fråga när du försöker karaktärisera sällsynta immunologisk undergrupper (d.v.s. tumör-specifika T-celler)12. Nyare tekniker såsom massa flödescytometri eller flödescytometri av flygtiden (CyTOF), möjliggöra högdimensionella fenotypiska analys av cellulära undergrupper med vissa system som stöder panel design som är större än 42 oberoende parametrar13. Trots den enorma kraften i CyTOF teknik i immun profilering, det är fortfarande begränsad på grund av bekostnad, analys expertis och tillgång till utrustningen. Dessutom många CyTOF protokoll rekommenderar rening av immun underdelar att förbättra signal-brus-förhållanden14, och därför föreslår vi att vår anrikning metod skulle kunna användas uppströms CyTOF analys för att förbättra datakvaliteten.
Detta dokument beskriver vi en tumör mikromiljö matsmältningen och analys metod som innehåller tumören immun infiltrera separation. Syftet med denna metod är att tillåta oberoende hög genomströmning profilering av tumör immun infiltrera och tumör cellulära fraktioner för bredare karaktärisering av den tumör mikromiljö. Med den här metoden visar vi ytterligare vikten av att utföra hela tumören analys, som en subkutan solid tumör modell har visat sig ha betydande rumsliga immunologisk heterogenitet. Sammantaget kan denna metod mer exakt och konsekvent jämföra mellan prover eftersom det berikar för immun cellulära undergrupper inom tumören och möjliggör oberoende profilering av tumör cell och immun bråkdelar av en tumör.
Protocol
Representative Results
Discussion
TIDEN består av olika och komplexa cellulära komponenter och molekyler. Nyligen tyder på att korrekt karakterisering av denna miljö kan ge en bättre förståelse för behandlingframgång eller misslyckande, och kan även hjälpa till att identifiera terapeutiska resistensmekanismer. Exempelvis kan öka intratumoral för olika immunsuppressiva celler (dvs. MDSCs, regulatoriska T-celler, etc.) minska effektor immunsvar och upphäva immunoterapeutisk effekter. Däremot, kan ökande intratumoral förek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN erkänner finansiellt stöd från National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) och nationella institutet för Dental & kraniofaciala forskning (F31DE026682) båda av National Institutes of Health. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health. Projektet stöddes också av flödescytometri och Cell sortering Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 och S10 RR024574) och expert hjälp av Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
