Verrijking en karakterisering van de Tumor immuun en niet-immune Microenvironments in gevestigde subcutane lymfkliertest tumoren
Summary
Hier beschrijven we een methode om te scheiden en verrijken van de componenten van de tumor immuun en niet-immuun communicatie in gevestigde subcutane tumoren. Deze techniek maakt het mogelijk voor de afzonderlijke analyse van tumor immuun infiltreren en niet-immuun tumor breuken die uitgebreide karakterisering van de tumor immuun communicatie kunnen toestaan.
Abstract
De tumor immuun communicatie (keer) heeft onlangs erkend als een kritische bemiddelaar van solide tumoren, met name voor immuuntherapie antistofrespons behandeling. Recente klinische vooruitgang in immunotherapie wijzen op de noodzaak voor reproduceerbare methoden om nauwkeurig en grondig karakteriseren de tumor en de bijbehorende immuun infiltreren. Tumor enzymatische spijsvertering en flow cytometrische analyse mogelijk globale karakterisering van talrijke immuun cel subsets en fenotypen; grondigheid van de analyse wordt echter vaak beperkt door fluorophore beperkingen op het deelvenster Ontwerp en de noodzaak om het verwerven van grote tumor monsters te observeren van zeldzame immuun populaties van belang. Zo hebben we een effectieve en hoge doorvoer-methode voor het scheiden en verrijken van de tumor immuun infiltreren van de niet-immuun tumor componenten ontwikkeld. De beschreven tumor spijsvertering en centrifugaal dichtheid gebaseerde scheiding techniek kunt afzonderlijke karakterisering van de tumor en tumor immuun infiltreren breuken behoudt cellulaire levensvatbaarheid en biedt dus een globale karakterisering van de tumor immunologische staat. Deze methode werd gebruikt voor het karakteriseren van de uitgebreide ruimtelijke immuun heterogeniteit in stevige tumors, die verder de noodzaak voor consistente hele tumor immunologische profiling technieken toont. Over het geheel genomen, deze methode biedt een effectieve en flexibele techniek voor de karakterisering van immunologische van subcutane solide lymfkliertest tumoren; als zodanig, deze tool kan worden gebruikt om beter karakteriseren de tumoraal immunologische functies en in de preklinische evaluatie van roman immunotherapeutische strategieën.
Introduction
De onderdrukkende tijd is onlangs erkend als een stempel van kanker, en is bekend om te spelen een belangrijke rol in de ontwikkeling, progressie en bescherming van de solide tumor kankers, evenals verzachten van hun gevoeligheid voor immunotherapie1. De tijd is samengesteld uit tal van cellulaire deelverzamelingen en fenotypen, die allemaal kritisch inzicht geven in de immunologische toestand van de tumor. Deze immunologische deelverzamelingen kunnen verder worden gelaagde in cellen van lymfocyt of myeloïde oorsprong, die tezamen het merendeel van de aangeboren en adaptieve immuunresponsen2,3 vormen. Recente ontwikkelingen op het gebied van kanker immunotherapie is gebleken dat immunotherapeutische strategieën (dat wil zeggen, immuun checkpoint remmers, chimeer antigeen receptor T-cellen, enz.) het potentieel hebben voor het opwekken van duurzame kanker regressies; ze blijven echter relatief inefficiënt in4,5van de kankers van de stevige tumor. Talrijke groepen de kritische hindernis hebben aangetoond dat de tijd op de behandeling succes6,7 spelen kunt, en er dus een noodzaak om te nauwkeurig evalueren nieuwe immuuntherapie in de pre-klinische setting blijft, specifiek gericht op hun mogelijkheid om te moduleren of de tijd8overwinnen.
Huidige inspanningen te karakteriseren van de tijd meestal gebruiken beide microscopie of stroom cytometry samen met antilichaam labeling van strategieën om immuun cellulaire deelverzamelingen en hun functies9,10te identificeren. Deze twee strategieën informeren uniek verschillende, zoals microscopie ruimtelijke waardering van cellulaire deelverzamelingen kunt en stroom cytometry hoge doorvoer en bredere kwantificering van cellulaire veranderingen biedt. Ondanks de recente verbeteringen in fluorescerende multiplex immunohistochemistry optimaliseren van spectrale imaging systemen, die nu kunnen maximaal 7 parameters worden ondersteund, beperkte deelvenster grootte bemoeilijkt brede niveau immuun profilering en deze techniek is dus vaak gereserveerd voor meer gerichte analyses. Dientengevolge, blijft stroom cytometry een van de meest gebruikte immuun profilering technieken. Ondanks het wijdverbreide gebruik in tijd karakterisering zijn de methoden die worden gebruikt voor het verwerken en kleuring heel variabel. Vaakst protocollen gebruiken een tumor distantiëren van enzym (dat wil zeggen, collagenases, DNase, etc.) en handmatige dissociatie methoden om eencellige schorsingen, gevolgd door antilichaam kleuring en analyse7. Ondanks de voordelen van elke methode, hebben talrijke groepen aangetoond de uitgebreide variabiliteit die kan worden opgewekt door middel van deze technieken-11. Dit maakt vergelijkingen van de Kruis-studie van tumor communicatie profilering uiterst moeilijk, zelfs bij de beoordeling van de dezelfde lymfkliertest tumor-model. Bovendien, deze methoden bieden beperkte mogelijkheden te evalueren van de cellulaire tumor en tumor immuun infiltreren componenten onafhankelijk, aangezien beide componenten worden afgewisseld na vertering. Monster hoeveelheid beperkt dan multi panel kleuring en analyse, die een groot probleem wordt wanneer u probeert te karakteriseren van zeldzame immunologische deelverzamelingen (dat wil zeggen, tumor-specifieke T-cellen)12. Meer recente technieken zoals massa cytometry of cytometry van de tijd van de vlucht (CyTOF), voldoende hoge-dimensionale fenotypische analyse van cellulaire deelverzamelingen met sommige systemen ondersteunen panel ontwerpen van meer dan 42 onafhankelijke parameters13. Ondanks de enorme kracht van CyTOF technologie in immuun profilering, blijft het beperkt vanwege de kosten, de deskundigheid van de analyse en de toegang tot de apparatuur. Bovendien, vele CyTOF protocollen adviseren zuivering van immuun deelverzamelingen om signal-to-noise verhouding14, en dus we suggereren dat onze verrijking methode kan worden gebruikt voor CyTOF analyse ter verbetering van de kwaliteit van de gegevens.
Hierin beschrijven we een tumor communicatie spijsvertering en analyse methode waarin tumor immuun infiltreren scheiding. Het doel van deze methode is dat de onafhankelijke high-throughput profilering van de tumor immuun infiltreren en tumor cellulaire breuken voor bredere karakterisering van de communicatie van de tumor. Met behulp van deze methode, wij verder laten zien het belang van het uitvoeren van de analyse van de hele tumor, zoals een subcutane solide tumor model bleek te hebben belangrijke immunologische tot ruimtelijke heterogeniteit. Over het geheel genomen, deze methode kan nauwkeuriger en consequent vergelijken tussen monsters omdat het verrijkt voor immuun cellulaire subsets binnen de tumor en voorziet in onafhankelijke profilering van de cel van de tumor en immuun breuken van een tumor.
Protocol
Representative Results
Discussion
De tijd is samengesteld uit diverse en complexe cellulaire componenten en moleculen. Recent bewijs suggereert dat nauwkeurige karakterisering van deze omgeving kan zorgen voor een beter begrip van de behandeling succes of mislukking, en kan zelfs helpen bij het identificeren van de mechanismen van therapeutische resistentie. Bijvoorbeeld, kan toenemende intratumoral van verschillende immunosuppressieve cellen (dat wil zeggen, MDSCs, regulatoire T-cellen, enz.) verzachten effector immuunresponsen en trek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JMN erkent financiële steun van het National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) en het nationale Instituut van Dental & craniofaciale onderzoek (F31DE026682) die zowel van de National Institutes of Health. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijk de officiële standpunten van de National Institutes of Health. Dit project was het ook ondersteund door het Cytometry en de cel Sorteren kern aan Baylor College of Medicine met financiële steun van de NIH (P30 AI036211 P30 CA125123 en S10 RR024574) en de deskundige hulp van Joel M. Sederstrom.
Materials
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
