Устные биопленки на различных материалах для стоматологических имплантатов
Summary
Здесь мы представляем протокол для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы для абатментов протезирование, включая анализ жизнеспособности клеток бактерий и морфологические характеристики. Модель на месте , связанная с мощными микроскопии методов используется для анализа устного биопленки.
Abstract
Зубные имплантаты и их компоненты протеза, склонны к бактериальной колонизации и биопленки. Использование материалов, что обеспечивает низкий адгезию микробов может уменьшить распространенность и прогрессирование заболеваний Пери имплантат. С учетом устных среды сложности и устных биопленки неоднородность, микроскопия, необходимой техники, которая может позволить биопленки анализ поверхностей зубов и стоматологические материалы. Эта статья описывает последовательность протоколов, для сравнения устные биопленки на титана и керамических материалов для опоры протезов, а также методы, участвующих в устной биоплёнки анализы на морфологических и клеточном уровнях. В situ модель для оценки устного биопленки на титана и циркония материалы для протеза опор, как описано в настоящем исследовании обеспечивает удовлетворительный сохранение 48 h биопленки, продемонстрировав тем самым методологических адекватности. Multiphoton микроскопии позволяет анализ зональный представитель биопленки, сформированные на тестовые материалы. Кроме того использование флуорофоров и обработки изображений, с помощью multiphoton микроскопии позволяет анализ бактериальной жизнеспособности в очень гетерогенной популяции микроорганизмов. Подготовка электронной микроскопии биологических образцов способствует структурной сохранению биопленки, изображения с хорошим разрешением и никаких артефактов.
Introduction
Бактериальные биопленки являются сложными, функционально и структурно организованы микробных сообществ, характеризуется разнообразием видов микроорганизмов, которые синтезировать внеклеточные, биологически активных полимеров матрица1,2. Бактериальной адгезии биотические или абиотические поверхностей предшествует формирование приобретенных пленкой, главным образом состоящая из слюнных гликопротеинов1,3,4. Слабая физико-химических взаимодействий между микроорганизмы и пленка изначально создаются и следуют сильнее взаимодействий между бактериальной адгезины и рецепторы гликопротеина приобретенных пленки. Микробного разнообразия постепенно увеличивает через coaggregation вторичного колонизаторами на рецепторы уже вложенных бактерий, образуя многовидовыми сообщества1,3,4, 5.
Гомеостаза устные микробиоту и симбиотические отношения с принимающей имеет важное значение в поддержании гигиены полости рта. Дисбактериоз в устной биоплёнки может увеличить риск развития кариеса и заболеваний пародонта2,5. Клинические исследования демонстрируют причинно следственные взаимосвязи между накоплением биопленки на зубы и имплантаты и развитие гингивита или Пери имплантат мукозита6,7. Прогрессирования воспалительного процесса приводит к периимплантита и последующей утрате имплантата8.
Зубные имплантаты и их компоненты протеза, склонны к бактериальной колонизации и биопленки формирования9. Использование материалов с химическим составом и топографии поверхности, что обеспечивает низкий адгезию микробов может уменьшить распространенность и прогрессирования заболевания Пери имплантат9,10. Титан является наиболее распространенным материалом для изготовления протезов абатментов для имплантатов; Однако керамические материалы были недавно введены и набирают популярность как альтернатива титана благодаря их эстетическим свойствам и биосовместимость11,12. Также важно, керамические материалы были связаны с якобы снижение потенциалом присоединиться к микроорганизмам, главным образом благодаря их шероховатости поверхности, смачиваемости и поверхности свободной энергии10,13.
В vitro исследования способствовали значительные успехи в понимании микробной адгезии для протезирования Абатмент поверхности9,14,,1516,17. Однако динамической среды полости рта, характеризуются различной температуры и рН и наличия питательных веществ, а также присутствие сил сдвига, не воспроизводится в пробирке экспериментально протоколы18, 19. Для преодоления этой проблемы, альтернативой является использование в situ моделей биопленки, который выгодно сохраняет свою трехмерную структуру для ex vivo анализа10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
Анализ сложной структуры биопленки, сформированные на устные субстратов требует использования методов микроскопии, способного отображать оптически плотного вопрос25. Multiphoton лазерная сканирующая микроскопия является современным вариантом для биопленки структурный анализ26. Он характеризуется использованием нелинейной оптики с источником освещения рядом инфракрасные волны, пульсирующий до фемтосекунд27. Этот метод показан для захвата изображений аутофлюоресценция материалов или материалов, отмечен флуорофоров, помимо изображений, генерируемых нелинейных оптических сигналов, полученных от явления, известного как второе поколение гармонических. Среди преимуществ multiphoton микроскопии является глубина большие изображения, полученные с минимальным клеток, причиненный интенсивность света возбуждения27.
Для анализа жизнеспособности биопленки на абиотические поверхностей multiphoton микроскопии использование флуоресцентных нуклеиновой кислоты красители с различные спектральные характеристики и мощность проникновения в бактериальных клетках требуется28. Флуорофоров SYTO9 (зеленый люминесцентные) и пропидий йодидом (красный люминесцентные) может использоваться для визуального разграничения между живые и Мертвые бактерии28,29,30. Пропидий йодидом проникает только бактерии с поврежденной мембраны, в то время как SYTO9 входит бактериальной клетки с нетронутыми и нарушенной мембраны. Когда оба красители присутствуют внутри клетки, пропидий йодидом имеет большее сродство нуклеиновых кислот и вытесняет SYTO9, пометив его красный28,30.
С учетом устных среды сложности и устных биопленки неоднородность, микроскопия, необходимой техники, которая может позволить биопленки анализ поверхностей зубов и стоматологические материалы. Эта статья описывает последовательность протоколов, для сравнения устные биопленки на титана и керамических материалов для опоры протезов, а также методы, участвующих в устной биоплёнки анализы на морфологических и клеточном уровнях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в настоящем исследовании была разработана для оценки биопленки на титана и циркония материалы для протезирования опор, включая анализ жизнеспособности бактериальных клеток и морфологические характеристики. Для того, чтобы достичь этого, был разработан в situ м?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Хосе Аугусто Maulin микроскопии многопользовательской лаборатории (школа медицины Рибейран-Прету) за его щедрую помощь с ЭЦП и SEM анализов и Hermano Тейшейра Мачадо за его щедрую техническую помощь в издании видео.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
