تشكيل بيوفيلم الشفوي في المواد المختلفة لزراعة الأسنان
Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتقييم تكوين بيوفيلم الشفوي على مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم الأسنان الاصطناعية، بما في ذلك تحليل الجدوى الخلايا البكتيرية والخصائص المورفولوجية. نموذج في الموقع المرتبطة بتقنيات الفحص المجهري قوية يستخدم لتحليل بيوفيلم الشفوي.
Abstract
زراعة الأسنان ومكوناتها الاصطناعية المعرضة للاستعمار الجرثومي وتشكيل بيوفيلم. قد يقلل استخدام المواد التي توفر التصاق الميكروبات منخفضة بانتشار وتطور الأمراض زرع المناطق المحيطة بالمدن. وبالنظر إلى البيئة عن طريق الفم التعقيد والفم بيوفيلم التغايرية، الفحص المجهري التقنيات اللازمة التي تمكن من إجراء تحليل بيوفيلم لأسطح الأسنان ومواد طب الأسنان. توضح هذه المقالة سلسلة من البروتوكولات التي نفذت لمقارنة تشكيل بيوفيلم الشفوي على التيتانيوم ومواد خزفية للدعائم الاصطناعية، فضلا عن أساليب المشاركة في تحليلات الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستويات المورفولوجية والهاتف الخلوي. يوفر الطراز في الموقع لتقييم تشكيل بيوفيلم شفويا في مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم بدلة الأسنان كما هو موضح في هذه الدراسة الحفاظ على مرض بيوفيلم ح 48، مدللة بذلك على مدى ملاءمة المنهجية. مولتيفوتون المجهري يسمح تحليل المجال ممثل بيوفيلم شكلت في اختبار المواد. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام فلوروفوريس، ومعالجة الصور باستخدام الفحص المجهري مولتيفوتون يسمح تحليل جدوى البكتيرية في عدد سكان متباينة للغاية من الكائنات الحية الدقيقة. إعداد العينات البيولوجية الميكروسكوب الإلكتروني يعزز الحفاظ على هيكلية بيوفيلم والصور مع قرار جيد، ولا التحف.
Introduction
الأغشية الحيوية البكتيرية معقدة، وظيفيا وهيكليا بتنظيم المجتمعات الميكروبية، وتتميز بتنوع الأنواع الميكروبية التي توليف مصفوفة بوليمر خارج الخلية، نشط بيولوجيا1،2. التصاق البكتيريا على أسطح أحيائياً أو غير أحيائي مسبوقاً بتشكيل من جليده المكتسبة، تتكون أساسا من جليكوبروتينس اللعابية1،،من34. في البداية ضعف التفاعلات الفيزيائية بين الكائنات الحية الدقيقة وجليده في المنشأة وتليها أقوى من التفاعلات بين أدهيسينس البكتيرية ومستقبلات بروتين سكري من جليده المكتسبة. التنوع الميكروبي يزيد تدريجيا من خلال كواجريجيشن المستعمرين الثانوية لمستقبلات البكتيريا الفعل المرفقة، تشكيل مجتمع المنصبة1،،من34، 5.
التوازن الحجمية الشفوي وعلاقتها التكافلية مع المضيف مهم في الحفاظ على صحة الفم والأسنان. ديسبيوسيس داخل الأغشية الحيوية عن طريق الفم قد تزيد من مخاطر تطوير نخر الأسنان وأمراض اللثة2،5. وتبين الدراسات السريرية علاقة السبب والنتيجة بين تراكم بيوفيلم في الأسنان أو زراعة الأسنان وتطوير التهاب اللثة أو المناطق المحيطة زرع التهاب الغشاء المخاطي6،7. تطور عملية التهاب يؤدي إلى المناطق المحيطة إيمبلانتيتيس وما يترتب عليه من ضياع زرع8.
زراعة الأسنان ومكوناتها الاصطناعية المعرضة للاستعمار الجرثومي و تشكيل بيوفيلم9. قد يقلل استخدام المواد بالتركيب الكيميائي وتضاريس السطح التي توفر التصاق الميكروبات منخفضة بانتشار وتطور المناطق المحيطة زرع الأمراض9،10. التيتانيوم هو المادة الأكثر استخداماً في صنع الأطراف الاصطناعية الدعائم ليزرع؛ ومع ذلك، أدخلت مؤخرا مواد السيراميك وتكتسب شعبية كبديل للتيتانيوم بسبب الخصائص الجمالية وتوافق مع الحياة11،12. أيضا الأهم من ذلك، مواد السيراميك ارتبطت مع احتمال انخفاض يفترض أن التمسك بالكائنات المجهرية، أساسا نظراً لخشونة السطح، ويتابيليتي، والطاقة الحرة السطحية10،13.
الدراسات في المختبر قد ساهمت في تحقيق تقدم كبير في فهم التصاق الجراثيم لدعمه الاصطناعية سطوح9،14،15،،من1617. ومع ذلك، البيئة الحيوية في تجويف الفم، تتميز باختلاف درجة الحرارة ودرجة الحموضة وتوافر المغذيات، فضلا عن وجود قوات القص، ليس استنساخه في المختبر البروتوكولات التجريبية18، 19. للتغلب على هذه المشكلة، وبديل هو استخدام النماذج في الموقع لتشكيل بيوفيلم، الذي يحفظ مفيد لها هيكل ثلاثي الأبعاد السابقين فيفو تحليل10،20، 21 , 22 , 23 , 24.
تحليل البنية المعقدة بيوفيلم تشكيل على ركائز الشفوي يتطلب استخدام تقنيات مجهرية قادرة على عرض المسألة بصريا كثيفة25. مولتيفوتون ليزر المسح المجهري خيار حديثة ل التحليل الهيكلي بيوفيلم26. ويتميز باستخدام البصريات غير الخطية مع مصدر إضاءة قريب من الطول الموجي تحت الحمراء، نابض فيمتوسيكوندس27. تتم الإشارة إلى هذا الأسلوب للحصول على صورة مواد أوتوفلوريسسينسي أو المواد التي تميزت فلوروفوريس، بالإضافة إلى الصور التي تم إنشاؤها بواسطة الإشارات الضوئية غير الخطية المستمدة من ظاهرة تعرف باسم “جيل التوافقي الثاني”. من بين مزايا الفحص المجهري مولتيفوتون هو عمق صورة كبيرة حصلت مع الخلية الحد الأدنى الأضرار الناجمة عن شدة الإثارة الخفيفة27.
تحليل جدوى من بيوفيلم على الأسطح اللاأحيائية بالفحص المجهري مولتيفوتون، استخدام الحمض النووي الفلورية الأصباغ مع الخصائص الطيفية المختلفة وقدرة اختراق في الخلايا البكتيرية المطلوب28. فلوروفوريس SYTO9 (أخضر-فلوري) ويوديد propidium (الأحمر-فلوري) يمكن استخدامها لتفريق بصرية بين البكتيريا الحية والميتة28،،من2930. يوديد Propidium تخترق البكتيريا فقط مع الأغشية التالفة، بينما يدخل SYTO9 الخلايا البكتيرية مع غشاء سليمة والمساس بها. عند كل الأصباغ موجودة داخل خلية، يوديد propidium لها صلة أكبر للأحماض النووية ويزيح SYTO9، وضع علامة عليه بالأحمر28،30.
وبالنظر إلى البيئة عن طريق الفم التعقيد والفم بيوفيلم التغايرية، الفحص المجهري التقنيات اللازمة التي تمكن من تحليل بيوفيلم أسطح الأسنان ومواد طب الأسنان. توضح هذه المقالة سلسلة من البروتوكولات التي نفذت لمقارنة تشكيل بيوفيلم الشفوي على التيتانيوم ومواد خزفية للدعائم الاصطناعية، فضلا عن أساليب المشاركة في تحليلات الأغشية الحيوية عن طريق الفم المستويات المورفولوجية والهاتف الخلوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
ووضع البروتوكول، المذكورة في هذه الدراسة لتقييم تكوين بيوفيلم مواد التيتانيوم وزركونيا للدعائم الاصطناعية، بما في ذلك تحليل الجدوى الخلية البكتيرية والخصائص المورفولوجية. من أجل تحقيق هذا الهدف، صمم في الموقع نموذجي لتشكيل بيوفيلم، تتألف من جهاز فموية قادرة على استيعاب عينات مواد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يشكر المؤلفون خوسيه أوغوستو مولين من “مختبر الفحص المجهري متعدد المستخدمين” (مدرسة الطب في ريبيراو بريتو) لمساعدته السخية مع EDS ووزارة شؤون المرأة التحليلات و Hermano تيكسيرا ماتشادو لمساعدته التقنية السخية في طبعة الفيديو.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
