Oral Biofilm bildning på olika material för tandimplantat
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att utvärdera oral biofilm bildning på Titan och zirkonium material för tandproteser distanser, inklusive analys av bakterieceller livskraft och morfologiska kännetecken. En i situ -modellen är associerad med kraftfulla mikroskopi tekniker används för oral biofilm analys.
Abstract
Dentala implantat och deras proteskomponenterna är benägna att bakteriell kolonisering och biofilm bildning. Användning av material som ger låg mikrobiell vidhäftning kan minska prevalensen och progression av peri-implantatet sjukdomar. Med tanke på den orala miljön komplexitet och oral biofilm heterogeniteten, mikroskopi tekniker behövs som kan aktivera en biofilm analys av ytorna på tänder och dentala material. Denna artikel beskriver en rad protokoll som genomförts för att jämföra oral biofilm bildning på Titan och keramiska material för protetiska distanser, liksom metoderna som är inblandade i oral biofilm analyser på morfologiska och cellulär nivå. I situ modellen att utvärdera oral biofilm bildning på Titan och zirkonium material för tandproteser distanser som beskrivs i denna studie ger en tillfredsställande bevarande av de 48 h biofilm, därmed visar metodologiska tillräcklighet. Multiphoton mikroskopi tillåter analys av ett område representativt av den biofilm som bildas på testmaterial. Användningen av fluorophores och bearbetning av bilderna med multiphoton mikroskopi kan du dessutom analysen av den bakteriella livskraften i en mycket heterogen population av mikroorganismer. Utarbetandet av biologiska prover för elektronmikroskopi främjar strukturella bevarandet av biofilm, bilder med bra upplösning och inga artefakter.
Introduction
Bakteriell biofilm är komplexa, funktionellt och strukturellt organiserade mikrobiella samhällen, kännetecknas av en mångfald av mikrobiell art att syntetisera en extracellulär, biologiskt aktiva polymer matris1,2. Den bakteriell vidhäftningen till biotiska och abiotiska ytor föregås av ett bildande av den förvärvade membran, huvudsakligen bestående av saliv glykoproteiner1,3,4. Svag fysikalisk-kemiska samspelet mellan mikroorganismer och den tunna hinnan är inledningsvis etablerat och följt av starkare samverkan mellan bakteriell adhesiner och glykoprotein receptorer av den förvärvade membran. Mikrobiell mångfald ökar gradvis genom coaggregation av sekundära kolonisatörerna till receptorsna av redan bifogade bakterier, bildar en Medelhavet gemenskapen1,3,4, 5.
Homeostas av den oral bakterieflora och dess symbiotiska förhållande med värden är viktigt att upprätthålla munhälsa. Dysbios inom oral biofilm kan öka risken för utveckling av karies och tandlossning2,5. Kliniska studier visar ett orsak-verkan samband mellan ansamling av biofilm på tänder eller implantat och utvecklingen av gingivit eller peri-implantatet mukosit6,7. Utvecklingen av den inflammatoriska processen leder till peri-implantitis och den påföljande förlusten av implantatet8.
Dentala implantat och deras proteskomponenterna är benägna att bakteriell kolonisering och biofilm bildning9. Användning av material med en kemisk sammansättning och ytans topografi som ger låg mikrobiell vidhäftning kan minska prevalensen och progression av peri-implantatet sjukdomar9,10. Titan är det vanligaste materialet för tillverkning av protetiska distanser för implantat; men keramiska material nyligen introducerade och ökar i popularitet som ett alternativ till Titan på grund av deras estetiska egenskaper och biokompatibilitet11,12. Också viktigt, har keramiska material förknippats med en förment reducerad potential att följa mikroorganismer, främst på grund av sin ytjämnhet, vätbarheten och ytan fri energi10,13.
In vitro studier har bidragit till betydande framsteg i förståelsen av mikrobiell vidhäftning till protetiska distansen ytor9,14,15,16,17. Dynamisk miljö i munhålan, kännetecknas av dess varierande temperatur och pH och näringsämnen tillgänglighet samt av förekomsten av skeva styrkor, är dock inte reproducerbart i in vitro- experimentella protokoll18, 19. För att lösa detta problem, är ett alternativ att utnyttja i situ modeller av biofilm bildning, som med fördel bevarar dess tredimensionella struktur för ex vivo analys10,20, 21 , 22 , 23 , 24.
Analysen av den komplexa strukturen av den biofilm som bildas på muntliga substrat kräver användning av mikroskopi tekniker kan visa optiskt tät materia25. Multiphoton laserscanning mikroskopi är ett modernt alternativ för biofilm strukturanalys26. Det kännetecknas av användning av ickelinjär optik med en belysning källa nära infraröd våglängd, pulsade femtosekunder27. Denna metod är indicerat för bild förvärv av autofluorescens material eller material som präglas av fluorophores, förutom bilder som genereras av icke-linjära optiska signaler som härrör från ett fenomen känt som harmoniska understödjautvecklingen. Bland fördelarna med multiphoton mikroskopi är det stora bilddjup erhålls med minsta cellskador orsakade av intensiteten av magnetiseringen ljus27.
För en livskraft analys av biofilm på abiotiska ytor av multiphoton mikroskopi, användning av fluorescerande nukleinsyra färgämnen med olika spektrala egenskaper och en penetration kapacitet i bakterieceller är krävs28. Fluorophores SYTO9 (grönt fluorescerande) och propidium jodid (röd fluorescerande) kan användas för en visuell differentiering mellan levande och döda bakterier28,29,30. Propidium jodid tränger bara bakterier med skadade membran, medan SYTO9 går in bakterieceller med en intakt och komprometterad membran. När både färgämnen finns inuti en cell, propidium jodid har större affinitet för nukleinsyror och förskjuter SYTO9, markera det röda28,30.
Med tanke på den orala miljön komplexitet och oral biofilm heterogeniteten, mikroskopi tekniker behövs som kan aktivera biofilm analysen av ytorna på tänder och dentala material. Denna artikel beskriver en rad protokoll som genomförts för att jämföra oral biofilm bildning på Titan och keramiska material för protetiska distanser, liksom metoderna som är inblandade i oral biofilm analyser på morfologiska och cellulär nivå.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet beskrivs i denna studie har utvecklats för att utvärdera den biofilm-bildningen på Titan och zirkonium material för protetiska distanser, inklusive analys av bakteriell cell livskraft och morfologiska kännetecken. För att åstadkomma detta, utformades en i situ -modell av biofilm bildning, bestående av en intraoral enhet som klarar att rymma prover av testmaterial och hålla dem utsätts för den dynamiska orala miljön för 48 h. Enheten ansågs bekväm och lätt att infoga, ta bort och reng?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar José Augusto Maulin från mikroskopi fleranvändar laboratorium (School of Medicine i Ribeirão Preto) för hans generösa hjälp med EDS och SEM analyser och Hermano Teixeira Machado för hans generösa tekniskt bistånd i video edition.
Materials
| Hydrogum 5 | Zhermack Dental | C302070 | |
| Durone IV | Dentsply | 17130500002 | |
| NiCr wire | Morelli | 55.01.070 | |
| JET auto polymerizing acrylic | Clássico | ||
| Dental wax | Clássico | ||
| Pressure pot | Essencedental | ||
| Sandpapers 600 grit | NORTON | T216 | |
| Sandpapers 1200 grit | NORTON | T401 | |
| Sandpapers 2000 grit | NORTON | T402 | |
| Metallographic Polishing Machine | Arotec | ||
| Isopropyl alcohol | SIGMA-ALDRICH | W292907 | |
| Hot melt adhesive | TECSIL | PAH M20017 | |
| Filmtracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | |
| Pipette Tips, 10 µL | KASVI | K8-10 | |
| Pipette Tips, 1,000 µL | KASVI | K8-1000B | |
| 24-well plate | KASVI | K12-024 | |
| Glass Bottom Dish | Thermo Scientific | 150680 | |
| AxioObserver inverted microscope | ZEISS | ||
| Chameleon vision ii laser | Coherent | ||
| Objective EC Plan-Neofluar 40x/1.30 Oil DIC | ZEISS | 440452-9903-000 | |
| SDD sensors – X-Max 20mm² | Oxford Instruments | ||
| Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G5882 | |
| Sodium cacodylate Buffer | SIGMA-ALDRICH | 97068 | |
| Osmium tetroxide | SIGMA-ALDRICH | 201030 | |
| Na2HPO4 | SIGMA-ALDRICH | S9638 | Used for preparation of phosphate buffered saline |
| KH2PO4 | SIGMA-ALDRICH | P9791 | |
| NaCl | MERK | 1.06404 | |
| Kcl | SIGMA-ALDRICH | P9333 | |
| Ethanol absolute for analysis EMSURE | MERK | 1.00983 | |
| CPD 030 Critical Point Dryer | BAL-TEC | ||
| JSM-6610 Series Scanning Electron Microscope | JEOL | ||
| SCD 050 Sputter Coater | BAL-TEC |
References
- Do, T., Devine, D., Marsh, P. D. Oral biofilms: molecular analysis, challenges, and future prospects in dental diagnostics. Clinical, Cosmetic and Investigational Dentistry. 5, 11-19 (2013).
- Samaranayake, L., Matsubara, V. H. Normal Oral Flora and the Oral Ecosystem. Dental Clinics of North America. 61 (2), 199-215 (2017).
- Larsen, T., Fiehn, N. E. Dental biofilm infections – an update. Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 125 (4), 376-384 (2017).
- Marsh, P. D., Do, T., Beighton, D., Devine, D. A. Influence of saliva on the oral microbiota. Periodontology 2000. 70 (1), 80-92 (2016).
- Marsh, P. D., Zaura, E. Dental biofilm: ecological interactions in health and disease. Journal of Clinical Periodontology. 44 Suppl 18, S12-S22 (2017).
- Zitzmann, N. U., Berglundh, T., Marinello, C. P., Lindhe, J. Experimental peri-implant mucositis in man. Journal of Clinical Periodontology. 28 (6), 517-523 (2001).
- Meyer, S., et al. Experimental mucositis and experimental gingivitis in persons aged 70 or over. Clinical and biological responses. Clinical Oral Implants Research. 28 (8), 1005-1012 (2017).
- Salvi, G. E., Cosgarea, R., Sculean, A. Prevalence and Mechanisms of Peri-implant Diseases. Journal of Dental Research. 96 (1), 31-37 (2017).
- Hahnel, S., Wieser, A., Lang, R., Rosentritt, M. Biofilm formation on the surface of modern implant abutment materials. Clinical Oral Implants Research. 26 (11), 1297-1301 (2015).
- Nascimento, C., et al. Bacterial adhesion on the titanium and zirconia abutment surfaces. Clinical Oral Implants Research. 25 (3), 337-343 (2014).
- Nakamura, K., Kanno, T., Milleding, P., Ortengren, U. Zirconia as a dental implant abutment material: a systematic review. The International Journal of Prosthodontics. 23 (4), 299-309 (2010).
- Scarano, A., Piattelli, M., Caputi, S., Favero, G. A., Piattelli, A. Bacterial adhesion on commercially pure titanium and zirconium oxide disks: an in vivo human study. Journal of Periodontology. 75 (2), 292-296 (2004).
- Nascimento, C., et al. Microbiome of titanium and zirconia dental implants abutments. Dental Materials. 32 (1), 93-101 (2016).
- Rimondini, L., Cerroni, L., Carrassi, A., Torricelli, P. Bacterial colonization of zirconia ceramic surfaces: an in vitro and in vivo study. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 17 (6), 793-798 (2002).
- de Avila, E. D., Avila-Campos, M. J., Vergani, C. E., Spolidorio, D. M., Mollo Fde, A. Structural and quantitative analysis of a mature anaerobic biofilm on different implant abutment surfaces. Journal of Prosthetic Dentistry. 115 (4), 428-436 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Impact of Physical Chemical Characteristics of Abutment Implant Surfaces on Bacteria Adhesion. Journal of Oral Implantology. 42 (2), 153-158 (2016).
- de Avila, E. D., et al. Effect of titanium and zirconia dental implant abutments on a cultivable polymicrobial saliva community. Journal of Prosthetic Dentistry. 118 (4), 481-487 (2017).
- Lin, N. J. Biofilm over teeth and restorations: What do we need to know?. Dental Materials. 33 (6), 667-680 (2017).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Tomas, I. The intraoral device of overlaid disk-holding splints as a new in situ oral biofilm model. Journal of Clinical and Experimental Dentistry. 7 (1), e126-e132 (2015).
- Prada-Lopez, I., Quintas, V., Vilaboa, C., Suarez-Quintanilla, D., Tomas, I. Devices for in situ Development of Non-disturbed Oral Biofilm. A Systematic Review. Frontiers in Microbiology. 7, 1055 (2016).
- Burgers, R., et al. In vivo and in vitro biofilm formation on two different titanium implant surfaces. Clinical Oral Implants Research. 21 (2), 156-164 (2010).
- do Nascimento, C., et al. Oral biofilm formation on the titanium and zirconia substrates. Microscopy Research and Technique. 76 (2), 126-132 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. In vivo study of the initial bacterial adhesion on different implant materials. Archives of Oral Biology. 58 (9), 1139-1147 (2013).
- Al-Ahmad, A., et al. Bacterial adhesion and biofilm formation on yttria-stabilized, tetragonal zirconia and titanium oral implant materials with low surface roughness – an in situ study. Journal of Medical Microbiology. 65 (7), 596-604 (2016).
- Thomsen, H., et al. Delivery of cyclodextrin polymers to bacterial biofilms – An exploratory study using rhodamine labelled cyclodextrins and multiphoton microscopy. International Journal of Pharmaceutics. 531 (2), 650-657 (2017).
- Lakins, M. A., Marrison, J. L., O’Toole, P. J., van der Woude, M. W. Exploiting advances in imaging technology to study biofilms by applying multiphoton laser scanning microscopy as an imaging and manipulation tool. Journal of Microscopy. 235 (2), 128-137 (2009).
- Zipfel, W. R., Williams, R. M., Webb, W. W. Nonlinear magic: multiphoton microscopy in the biosciences. Nature Biotechnology. 21 (11), 1369-1377 (2003).
- Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain, BacLight. Cytometry Part A. 61 (2), 189-195 (2004).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15, 36 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Placko, H. E., Mishra, S., Weimer, J. J., Lucas, L. C. Surface characterization of titanium-based implant materials. The International Journal of Oral & Maxillofacial Implants. 15 (3), 355-363 (2000).
- So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. Two-photon excitation fluorescence microscopy. Annual Review of Biomedical Engineering. 2, 399-429 (2000).
- Benninger, R. K., Piston, D. W. Two-photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Current Protocols in Cell Biology. , 11-24 (2013).
- Gardi, J. E., Nyengaard, J. R., Gundersen, H. J. The proportionator: unbiased stereological estimation using biased automatic image analysis and non-uniform probability proportional to size sampling. Computers in Biology and Medicine. 38 (3), 313-328 (2008).
- Melvin, N. R., Poda, D., Sutherland, R. J. A simple and efficient alternative to implementing systematic random sampling in stereological designs without a motorized microscope stage. Journal of Microscopy. 228 (Pt 1), 103-106 (2007).
- Neu, T. R., Kuhlicke, U., Lawrence, J. R. Assessment of fluorochromes for two-photon laser scanning microscopy of biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 68 (2), 901-909 (2002).
- Neu, T. R., Woelfl, S., Lawrence, J. R. Three-dimensional differentiation of photo-autotrophic biofilm constituents by multi-channel laser scanning microscopy (single-photon and two-photon excitation). Journal of Microbiological Methods. 56 (2), 161-172 (2004).
- Neu, T. R., Lawrence, J. R. Innovative techniques, sensors, and approaches for imaging biofilms at different scales. Trends in Microbiology. 23 (4), 233-242 (2015).
- Lacroix-Gueu, P., Briandet, R., Leveque-Fort, S., Bellon-Fontaine, M. N., Fontaine-Aupart, M. P. In situ measurements of viral particles diffusion inside mucoid biofilms. Comptes Rendus Biologies. 328 (12), 1065-1072 (2005).
- Briandet, R., et al. Fluorescence correlation spectroscopy to study diffusion and reaction of bacteriophages inside biofilms. Applied and Environmental Microbiology. 74 (7), 2135-2143 (2008).
- Berney, M., Hammes, F., Bosshard, F., Weilenmann, H. U., Egli, T. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry. Applied and Environmental Microbiology. 73 (10), 3283-3290 (2007).
- Bergmans, L., Moisiadis, P., Van Meerbeek, B., Quirynen, M., Lambrechts, P. Microscopic observation of bacteria: review highlighting the use of environmental SEM. International Endodontic Journal. 38 (11), 775-788 (2005).
- Hannig, C., Follo, M., Hellwig, E., Al-Ahmad, A. Visualization of adherent micro-organisms using different techniques. Journal of Medical Microbiology. 59 (Pt 1), 1-7 (2010).
- Knutton, S. Electron microscopical methods in adhesion. Methods in Enzymology. 253, 145-158 (1995).
- Fischer, E. R., Hansen, B. T., Nair, V., Hoyt, F. H., Dorward, D. W. Scanning electron microscopy. Current Protocols in Microbiology. , (2012).
