Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren
Summary
Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.
Abstract
Het doel van deze methode is te verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia verzameld uit losse, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). We hebben geconstateerd dat vijf stappen in de workflow die cruciaal zijn voor het verkrijgen van RNA isolaten van darmen ganglia met voldoende kwaliteit en kwantiteit voor RNA-seq. Ten eerste, bij de voorbereiding van intestinale weefsel, moet elk monster alle overtollige vloeistof verwijderd door bevlekken voorafgaand aan het sereus vlies zoveel mogelijk over de bodem van grote basis mallen afvlakken. Monsters zijn dan snel bevroren bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane. Ten tweede, wanneer afdelen van het weefsel, is het belangrijk om te cryomolds plaatsen, zodat de intestinale secties parallel het volledige vliegtuig van de plexus myenteric, waardoor de opbrengst van de grootste oppervlakte van darmen ganglia per dia. Derde, tijdens de LCM, polyethyleen napthalate (PEN)-membraan dia’s bieden de grootste snelheid en flexibiliteit in het overzicht van de niet-uniforme vormen van darmen ganglia bij het verzamelen van darmen ganglia. Ten vierde, voor verschillende visualisatie van darmen ganglia binnen secties, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, bieden uitstekende behoud van RNA integriteit ten opzichte van waterige kleurstoffen. Tot slot, voor de extractie van RNA van vastgelegde ganglia waargenomen we verschillen tussen commerciële RNA extractie kits die leverde superieure RNA hoeveelheid en kwaliteit, terwijl het elimineren van verontreiniging van het DNA. Optimalisatie van deze factoren in het huidige protocol sterk versnelt de workflow en levert darmen ganglia monsters met uitzonderlijke RNA kwaliteit en kwantiteit.
Introduction
Deze methode is ontworpen om kwalitatief hoogwaardige RNA monsters van darmen ganglia van menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM) krijgen. Het protocol hier beschreven is geoptimaliseerd om te zorgen voor voldoende RNA kwaliteit en opbrengsten voor RNA sequencing (RNA-seq) en is bedoeld om te worden gebruikt met vers gereseceerd nietgefixeerde, flash-bevroren intestinale menselijk weefsel.
Functionele gastro-intestinale en gut motiliteit aandoeningen invloed op één van de vier mensen in de Verenigde Staten. De darmen zenuwstelsel (ENS), ook wel aangeduid als de tweede hersenen1, is vaak in het midden van deze aandoeningen, zoals het speelt een cruciale rol in de homeostase van de darm en beweeglijkheid. Manipulatie van de beweeglijkheid van de darm is over het algemeen beperkt tot chirurgische resectie van de aganglionic/noncontractile weefsel, chronische dieet wijziging en/of medicijnen. Verrassend, de volledige transcriptoom van de volwassen ENS moet nog worden sequenced, sterk beperken ons vermogen om te identificeren van moleculen binnen de ENS die kunnen worden gericht farmaceutisch of gebruikt in stamcel-therapieën.
Er zijn relatief weinig methoden voor het isoleren van RNA van menselijke darmen ganglia. De eerste benadering, cel dissociatie2, vereist hoge incubatie temperaturen en lange incubatie tijden; zowel waarvan bekend is dat de aantasting van het RNA bevorderen en veranderen van de transcriptome2,3. Een alternatieve benadering, LCM, meer betrouwbaar transcriptome bewaart en beschermt RNA integriteit. Hoewel verscheidene studies hebben LCM gebruikt voor het verzamelen van de ganglia van vers bevroren menselijk intestinale weefsel4,5,6, deze benaderingen of werden gehinderd door de slechte RNA kwaliteit en kwantiteit, waren heel arbeidsintensief is, of benodigde wijziging van kleuring of RNA extractie technieken aan het werk in onze handen. Andere LCM protocollen ontworpen voor het behoud van RNA die werden gevonden in LCM product handleidingen aanvullende verbeteringen7,8, maar aanpassing nodig was geboden wanneer toegepast op het isolement van de darmen ganglia8, 9. om deze redenen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde protocol op basis van deze middelen dat aanzienlijke hoeveelheden van hoog-integriteit RNA van menselijke darmen ganglia oplevert, heeft een relatief snelle workflow en produceert consistente resultaten over een grote het aantal monsters.
In deze studie presenteren wij een synopsis van geoptimaliseerde procedures die het isolement van hoge-integriteit RNA van darmen ganglia afkomstig uit gereseceerd intestinale menselijk weefsel vergemakkelijken. Onze methode bevat vijf belangrijke aspecten. Eerste vers gereseceerd, nietgefixeerde menselijke intestinale monsters moeten worden ontdaan op maat, hebben alle overtollige vocht verwijderd met een weefsel van het laboratorium en afgevlakt in een grote basis mal vóór het flash-invriezen bovenop een gier van droogijs en 2-methylbutane (2-MB). Tweede, histologische secties van darm moeten bereid zijn te verkrijgen van het volledige vliegtuig van de plexus myenteric op een dia, met een grote lading van darmen ganglia. Succes met deze stap is grotendeels afhankelijk van het voorbereidingsproces van weefsel. Ten derde, de niet-uniforme structuur van ganglia in de ENS vereist het gebruik van polyethyleen napthalate (PEN) membraan dia’s6, die de grootste snelheid en precisie tijdens het LCM bieden. Vierde, ethanol-compatibele kleurstoffen, zoals Cresyl Violet, moeten worden gebruikt om RNA integriteit behouden blijft terwijl kleuring darmen ganglia. Laatst, het RNA extractieproces is essentieel voor een succesvol resultaat met RNA-Seq. We getracht een RNA extractie benadering die produceert hoge RNA integriteit, maximaliseert RNA opbrengsten bij het starten met kleine collecties van darmen ganglia elimineert DNA besmetting en behoudt zo veel RNA soorten mogelijk.
Tezamen, optimalisatie van deze factoren in de huidige studie sterk versnelt de workflow en levert monsters van darmen ganglia met uitzonderlijke RNA kwantiteit en kwaliteit. Resultaten zijn grotendeels overeen onder een omvangrijke groep van monsters, met vermelding van de samenhang van deze aanpak. Verder, wij zijn gewend deze benaderingen met succes tientallen van RNA samples uit de darmen ganglia volgnummer. De strategieën die gemarkeerd hier kunnen ook in grote lijnen worden aangepast voor het uitvoeren van de LCM van gewenste ganglia of kernen van de perifere en centrale zenuwstelsel en andere gevallen waarin het isolement van kwalitatief hoogwaardige RNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
Met deze procedure kunt het efficiënt verzamelen van talrijke darmen ganglia als een bron voor het afleiden van RNA voor RNA-seq. Hier hebben we de processen die worden beschreven in de bestaande protocollen maximaal behoud van RNA integriteit versneld. Zoals alle stappen in deze procedure onderling afhankelijk zijn zijn, is het belangrijk dat alle kwesties vanaf het begin van de studie worden geëlimineerd en dat alle monsters bereid zijn zo op dezelfde manier aan elkaar mogelijk te verkrijgen van betrouwbare RNA-seq.<…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan de donoren en hun families die dit werk mogelijk gemaakt. Wij waarderen ook de hulp van medewerkers aan het International Institute of Medicine en Tennessee donorschap voor het helpen van de coördinaat collectie van weefsel in deze studie gebruikt. Dit werk werd gesteund door subsidies van de National Institutes of Health, NIH OT2-OD023850 tot EMS2 en toelage ondersteuning van NIH T32-DK007673 naar AMZ. We zijn dankbaar voor personeel van de Vanderbilt translationeel pathologie gedeelde Resource voor toegang tot de LCM Instrument en adviezen over de voorbereiding van het weefsel. De Vanderbilt weefsel pathologie gedeelde Resource wordt gedeeltelijk ondersteund door de NIH grants P30-CA068485-14 en U24-DK059637-13. Wij danken het genoom Technology Access Center in het departement van genetica aan de Washington University School of Medicine voor hulp bij genomic analyse. De GTAC is slechts gedeeltelijk ondersteund door NCI Cancer Center ondersteuning Grant #P30 CA91842 aan de Siteman Cancer Center en ICT/CTSA Grant #UL1TR002345 van het National Center voor onderzoek middelen (NCRR), een onderdeel van de National Institutes of Health (NIH) en NIH Routekaart voor medisch onderzoek. Deze publicatie is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van NCRR of NIH.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
Referências
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
