Оптимизации лазер захват Microdissection для изоляции кишечных ганглиев от свежемороженые тканей человека
Summary
Цель настоящего Протокола заключается в том, для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, изолированных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Этот протокол предусматривает подготовка флэш замороженных образцов человеческой кишечника ткани, cryosectioning, обколоть окрашивание и обезвоживания, НОК и извлечение RNA.
Abstract
Этот метод предназначен для получения образцов РНК высокопрочные от кишечных ганглии, собранных от нефиксированной, свежезаваренным резецируется кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Мы определили пять шагов в рабочем процессе, которые имеют решающее значение для получения РНК изоляты от кишечных ганглиев с достаточно высокого качества и количества РНК seq. Во-первых при подготовке кишечника ткани, каждый образец должен иметь все лишнюю жидкость, удалены промокательной до рихтовки serosa как можно больше в нижней части большого базовой формы. Затем образцы быстро заморожены на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane. Во-вторых при резании ткани, важно располагать cryomolds кишечная разделам параллельно плоскости полная myenteric сплетения, тем самым давая наибольшую площадь поверхности кишечного ганглиев на слайд. В-третьих, во время LCM, полиэтилен napthalate (PEN)-мембраны слайды предлагают наибольшую скорость и гибкость в зарисовке неоднородной формы кишечной ганглии, при сборе интестинальная ганглии. В-четвертых для различных визуализации кишечных ганглиев в пределах секции, этанол совместимых красители, как количество кресил фиолетовый, предлагают отличные сохранение целостности РНК относительно водные красители. Наконец для извлечения РНК из захваченных ганглии, мы наблюдали различия между коммерческой РНК добыча комплекты, которые принесли Реновированый РНК и качества, устраняя загрязнения ДНК. Оптимизация этих факторов в текущий протокол значительно ускоряет процесс и дает кишечных ганглиев образцы с исключительной РНК качества и количества.
Introduction
Этот метод предназначен для получения высокого качества образцов РНК кишечных ганглиев от кишечных тканей человека с помощью лазера захвата microdissection (LCM). Протокол, описанные здесь был оптимизирован для обеспечения достаточной РНК качества и урожайности для РНК (РНК seq) последовательности и предназначен для использования с свежезаваренным резецируется, нефиксированных, флэш замороженные кишечных тканей человека.
Расстройства функциональные моторики желудочно-кишечного тракта и кишки затрагивает один из каждых четырех человек в Соединенных Штатах. Кишечные нервной системы (Ен), также именуемый второй мозг1, часто находится в центре этих расстройств, как она играет решающую роль в кишечнике гомеостаза и подвижности. Манипуляция сократительной способности кишечника обычно ограничивались хирургическая резекция aganglionic/noncontractile ткани, хронический диетическое изменение и/или лекарства. Удивительно полным транскриптом взрослых ENS остается последовательной, значительно ограничивает нашу способность идентифицировать молекул в ENS, которые могут быть направлены фармацевтически или используются в терапии стволовой клетки.
Существует относительно небольшое число методов для изоляции RNA от человека кишечные ганглии. Первый подход, клетки диссоциации2, требует температуры высокой инкубации и длительный инкубационный раз; оба из которых известны содействовать деградации РНК и изменить транскриптом2,3. Альтернативный подход, НОК, более надежно сохраняет транскриптом и защищает целостность РНК. Хотя ряд исследований использовали LCM для сбора ганглиев от кишечных тканей человека свежемороженые4,5,6, эти подходы были либо затруднены бедных РНК качества и количества, были довольно трудоемкий, или необходимые модификации пятнать или РНК добыча методы для работы в наших руках. Другие LCM протоколы предназначены для сохранения РНК, которые были найдены в продукте LCM, предоставляемых пособий, дополнительные усовершенствования7,8, но адаптация необходима при применении к изоляции кишечных ганглиев8, 9. по этим причинам, мы разработали оптимизированный протокол, основанный на эти ресурсы, дает значительное количество высокопрочные РНК от человека кишечные ганглии, имеет сравнительно быстрый рабочий процесс и производит последовательные результаты через большой Количество выборок.
В этом исследовании мы представляем краткий обзор оптимизации процедур, которые способствуют изоляции высокопрочные РНК от кишечных ганглии, получены из резекции кишечника ткани человека. Наш метод включает в себя пять важных аспектов. Во-первых, свежезаваренным резецируется, незафиксированная человека кишечные образцы должны быть сокращены до размера, имеют все излишки влаги удален с ткани лаборатории и выравнивается в большой базы плесень до флэш замораживания на вершине раствор сухого льда и 2-methylbutane (2 МБ). Во-вторых, гистологическое части кишечника должны быть готовы получить полное плоскости myenteric сплетения на слайде, который предлагает большой полезной кишечной ганглии. Успех этого шага в значительной степени зависит от процесса подготовки ткани. В-третьих неоднородной структуры ганглиев в ENS требует использования полиэтиленовых napthalate (PEN) мембраны слайды6, который предлагают наибольшую скорость и точность в процессе НОК. Четвертый, этанол совместимых красителей, таких как количество кресил фиолетовый, должны использоваться для сохранения целостности РНК во время окрашивания кишечных ганглии. Наконец процесс извлечения РНК имеет решающее значение для успешного исхода с РНК-последующие Мы стремились РНК добыча подход, который производит высокой целостности РНК, максимизирует РНК урожайности при запуске с небольшими коллекциями кишечных ганглиев, устраняет загрязнения ДНК и сохраняет как много видов РНК как можно скорее.
Вместе взятые, оптимизация этих факторов в настоящем исследовании значительно ускоряет процесс и дает образцы кишечных ганглиев с исключительной РНК количества и качества. Результаты были во многом согласуется среди значительные группы образцов, указывающее последовательность этого подхода. Кроме того мы использовали эти подходы для успешной виртуализации десятки образцов РНК от кишечных ганглии. Стратегии, подчеркнул здесь также может быть широко адаптирована для выполнения LCM желаемого ганглиев или ядер периферической и центральной нервной системы и других случаях, требующих изоляции высокого качества РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта процедура позволяет эффективного сбора многочисленных кишечных ганглиев в качестве источника для получения РНК для РНК seq. Здесь мы ускорили процесс, изложенные в существующих протоколах, максимально сохраняя целостность РНК. Поскольку все шаги в этой процедуре являются взаимоза?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны донорам и их семей, которые сделали возможной эту работу. Мы также ценим помощь персонала в Международный Институт медицины и Теннесси доноров услуг для помогать координировать коллекции ткани, используемые в данном исследовании. Эта работа была поддержана грантов от национальных институтов здоровья, низ OT2-OD023850 EMS2 и стипендиальной поддержки от НИЗ T32-DK007673 до AMZ. Мы благодарны сотрудникам Вандербильта трансляционная патологии общих ресурсов для доступа к LCM инструмент и консультации по подготовке ткани. Общий ресурс патологии Вандербильта ткани частично поддерживается NIH грантов P30-CA068485-14 и U24-DK059637-13. Мы благодарим генома центр технологий доступа в отдел генетики в Вашингтоне школы медицины университета за помощь с геномного анализа. GTAC частично поддерживается NCI рака центр поддержки Грант #P30 CA91842 в Siteman центр рака и ИКТ/CTSA #UL1TR002345 грант от национального центра для исследования ресурсов (NCRR), компонент национальных институтов здравоохранения (НИЗ) и низ Дорожная карта для медицинских исследований. Эта публикация является исключительно ответственности авторов и вовсе не обязательно отражает официальное мнение NCRR или низ.
Materials
| 10% Neutral-buffered formalin | Sigma | HT501128-4L | |
| 2-Methylbutane | Fisher | O3551-4 | |
| 3-mL syringe | BD | 309628 | |
| 50-mL conical tubes, polypropylene | Corning | 05-526B | |
| Base molds 37x24x5mm, disposable | Electron Microscopy Sciences | 5025511 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | N.A. | |
| CapSure Macro LCM caps | Arcturus, ThermoFisher | LCM0211 | |
| Cling Wrap, Press’n Seal | Glad | N.A. | |
| Cresyl Violet Acetate | Acros Organics | AC405760025 | |
| Cutting Board | Electron Microscopy Sciences | 63308 | |
| Ethanol, 190-proof | Pharmco-AAPER | 111000190 | |
| Ethanol, 200-proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Glass Microscope slides | Fisher | 12-550-343 | |
| Gloves, extended cuff | Microflex | 19010144 | |
| Gowns, surgical-disposable | Kimberly-Clark | 19-088-2116 | |
| Tray, 20 L (large polypropylene sterilizing pan) | Nalgene | 1335920B | |
| Kimwipes (large) | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Kimwipes (small) | Kimberly-Clark | 34133 | |
| Laser Capture Microdissection System (ArcturusXT) | ThermoFisher | N.A. | |
| Leica Cryostat Chuck, large, 40 mm | Southeast Pathology Instrument Service | N.A. | |
| Light Microscope | Olympus | CX43 | |
| Microscope objective (20X) | Olympus UPlanFl 20X/0.50, ∞/0.17 | N.A. | |
| Microscope objective (10X) | Olympus UPlanFl 10X/0.25, ∞/- | N.A. | |
| Molecular Sieves | Acros Organics | AC197255000 | |
| Nuclease-free water | Ambion | AM9937 | |
| PicoPure RNA extraction kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| Pellet Pestle | Kimble Kontes | 4621973 | |
| PEN membrane LCM slides | Arcturus, ThermoFisher | LCM022 | |
| RNase-free tubes, 1.5 mL | Ambion | AM12400 | |
| RNaseZAP | Sigma | Sigma-R2020 | |
| RNA Extraction Kit "A" (PicoPure) | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| RNA Extraction Kit "B" (RNeasy Micro kit) | Qiagen | 74004 | |
| RNA Extraction Method "C" (TRIzol) | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA Extraction Kit "D" (RNeasy PLUS Mini kit) | Qiagen | 74134 | |
| Splash Shield, disposable faceshield | Fisher | 17-310 | |
| Scissors, Surgical, 14.5 cm "sharp-sharp" | Fine Science Tools | 14002-14 | |
| Syringe filter, cellulose acetate (0.2 μm) | Nalgene | 190-2520 | |
| Tissue Freezing Medium | General Data Healthcare | TFM-5 | |
| Xylenes | Fisher | X3P1GAL |
Referências
- Gershon, M. D. . The second brain : the scientific basis of gut instinct and a groundbreaking new understanding of nervous disorders of the stomach and intestine. , (1998).
- Grundmann, D., Klotz, M., Rabe, H., Glanemann, M., Schafer, K. H. Isolation of high-purity myenteric plexus from adult human and mouse gastrointestinal tract. Scientific Reports. 5, 9226 (2015).
- Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17, 36 (2010).
- Bottner, M., et al. Laser microdissection as a new tool to investigate site-specific gene expression in enteric ganglia of the human intestine. Neurogastroenterology and Motility. 22 (2), 168-172 (2010).
- Clement-Ziza, M., Munnich, A., Lyonnet, S., Jaubert, F., Besmond, C. Stabilization of RNA during laser capture microdissection by performing experiments under argon atmosphere or using ethanol as a solvent in staining solutions. RNA. 14 (12), 2698-2704 (2008).
- Hetz, S., et al. Age-related gene expression analysis in enteric ganglia of human colon after laser microdissection. Front Aging Neurosci. 6, 276 (2014).
- . PALM Protocols – RNA handling Available from: https://hcbi.fas.harvard.edu/files/zeiss_labprotocol_rna_0811.pdf (2011)
- . Workflows & Protocols: How to Use a Leica Laser Microdissection System and Qiagen Kits for Successful RNA Analysis Available from: https://www.leica-microsystems.com/science-lab/laser-microdissection/workflows-protocols-how-to-use-a-leica-laser-microdissection-system-and-qiagen-kits-for-successful-rna-analysis/ (2015)
- . Arcturus HistoGene Frozen Section Staining Kit: User Guide. Biosystems, A. , (2010).
- Cummings, M., et al. A robust RNA integrity-preserving staining protocol for laser capture microdissection of endometrial cancer tissue. Analytical Biochemistry. 416 (1), 123-125 (2011).
- Grover, P. K., Cummins, A. G., Price, T. J., Roberts-Thomson, I. C., Hardingham, J. E. A simple, cost-effective and flexible method for processing of snap-frozen tissue to prepare large amounts of intact RNA using laser microdissection. Biochimie. 94 (12), 2491-2497 (2012).
- Heumuller-Klug, S., et al. Degradation of intestinal mRNA: a matter of treatment. World Journal of Gastroenterolology. 21 (12), 3499-3508 (2015).
- Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification. BMC Biology. 12, 42 (2014).
- Sigurgeirsson, B., Emanuelsson, O., Lundeberg, J. Sequencing degraded RNA addressed by 3′ tag counting. PLoS One. 9 (3), 91851 (2014).
- Potter, S. S., Brunskill, E. W. Laser capture. Methods in Molecular Biology. 886, 211-221 (2012).
- Funke, B. Laser microdissection of intestinal epithelial cells and downstream analysis. Methods in Molecular Biology. 755, 189-196 (2011).
- Kolijn, K., van Leenders, G. J. Comparison of RNA extraction kits and histological stains for laser capture microdissected prostate tissue. BMC Res Notes. 9, 17 (2016).
- Muyal, J. P., Muyal, V., Kaistha, B. P., Seifart, C., Fehrenbach, H. Systematic comparison of RNA extraction techniques from frozen and fresh lung tissues: checkpoint towards gene expression studies. Diagnostic Pathology. 4, 9 (2009).
- Mikulowska-Mennis, A., et al. High-quality RNA from cells isolated by laser capture microdissection. Biotechniques. 33 (1), 176-179 (2002).
- Pietersen, C. Y., Lim, M. P., Woo, T. U. Obtaining high quality RNA from single cell populations in human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).
- Guo, M., Wang, H., Potter, S. S., Whitsett, J. A., Xu, Y. SINCERA: A Pipeline for Single-Cell RNA-Seq Profiling Analysis. PLoS Computational Biololgy. 11 (11), 1004575 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
