Fare kalp çalışma için ışık sayfalık floresans mikroskobu
Summary
Bu çalışmada optik takas ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışık sayfalık floresans mikroskobu (LSFM) fare kalp çalışmaya kullanmaktadır.
Abstract
Işık sayfalık floresans mikroskobu mikrometre yüksek bir Aksiyel çözünürlüğünden milimetre ölçek ile hızlı resim alma için yaygın olarak kullanılmış. Geleneksel ışık sayfalık teknikleri uygun örnek doku yönettiği bir tek aydınlatma ışın kullanımı dahil. Bir tek aydınlatma ışını kullanılarak üretilen büyük örnekleri görüntüleri şeritler veya eserler içeren ve düşük çözünürlüğe saçılma ve doku tarafından ışık emilimi nedeniyle muzdarip. Bu çalışmada bir çift taraflı aydınlatma ışını ve Basitleştirilmiş netlik fare kalp için teknik Temizleme optik kullanır. Bu teknikler yürekten lipidler kaldırarak daha derin görüntüleme için izin ve büyük bir alan görüntüleme, 10 x 10 x 10 mm3daha büyük üreten. Sonuç olarak, bu strateji ventrikül boyutları ölçmek, kardiyak lineage izlemek ve kardiyak spesifik proteinler ve iyon-kanalları Doğum sonrası yetişkin fare kalpler yeterli kontrast için kayma dağılımını yerelleştirmek bize sağlar ve çözünürlük.
Introduction
Işık sayfalık floresans mikroskobu ilk 1903 yılında geliştirilen bir teknik olduğunu ve bugün bir yöntem olarak gen ekspresyonu çalışma ve doku örnekleri1,2,33-b veya 4-D modelleri üretmek için kullanılır. Böylece sadece o uçağı dedektörü tarafından yakalanır örneği tek bir uçağı aydınlatmak için ışık ince bir levha bu görüntüleme yöntemini kullanır. Örnek sonra eksenel yönde her yakalamak için hareket edebilir, her seferinde bir bölümü katman ve 3B modele alınan görüntüleri4sonrası işlendikten sonra render. Ancak, emme ve fotonlar saçılma nedeniyle, LSFM ya da birkaç mikron kalınlığında veya optik şeffaf1örnekleri sınırlı olmuştur.
LSFM sınırlamaları optik şeffaf, zebra balığı gibi dokulara sahip organizmaların kapsamlı çalışmalar yol açmıştır. İnsanlar ve zebra balığı5,6arasında korunmuş gen olduğundan kalp geliştirme ve farklılaşma ilgili çalışmalar kez zebra balığı üzerinde yapılmaktadır. Bu çalışmalar kalp araştırma kardiyomiyopatiler6,7‘ ye ile ilgili gelişmeler yol açmıştır, ancak, bu hala memeliler gibi üst düzey organizmalar üzerinde benzer araştırma yapmak gerek vardır.
Memeli kalp doku kalınlığı ve opaklık doku, kırmızı kan hücreleri ve tek taraflı aydınlatma geleneksel LSFM yöntemleri1 altında örnek nedeniyle oluşur şeritleme hemoglobin nedeniyle emme nedeniyle bir meydan okuma sunuyor , 8. Bu sınırlamalar için telafi etmek için biz çift taraflı aydınlatma ve çözüm (jant) eşleşen bir kırılma indisi ile kombine netlik tekniği9 basitleştirilmiş bir sürümünü kullanmak için önerilen. Bu nedenle, bu sistem bakımı iyi nitelik kararlılık Aksiyel ve yanal8uçak iken 10 x 10 x 10 mm3 daha büyük bir örnek görüntüleme için sağlar.
Bu sistem ilk floresan boncuk cam boru içinde farklı konfigürasyonlarda düzenlenmiş kullanılarak kalibre. Sonra sistem Doğum sonrası ve yetişkin fare kalpler görüntü için kullanıldı. İlk olarak, Doğum sonrası fare kalp 7 gün (ventrikül boşluğuna, kalınlığı ventrikül duvar, vana yapıları ve trabeculation varlığını ortaya çıkarmak için P7) görüntüsü. İkinci olarak, bir çalışma cardiomyocytes 1 gün (P1) Cre etiketli cardiomyocytes ve Sarı floresan protein (YFP) ile Doğum sonrası fare kalp kullanarak hücre tanımlamak için yapılmıştır. Son olarak, yetişkin fareler 7,5 aylıkken böbrek dış medüller potasyum varlığı (ROMK) kanalları gen terapisi8‘ den sonra gözlemlemek için görüntüsü.
Protocol
Representative Results
Discussion
LSFM sistemi ve burada açıklanan tekniği kullanır onun gelişim Doğum sonrası ve yetişkin aşamasında görüntü fare kalp için bir optik temizlenmesi ile kombine bir çift taraflı aydınlatma ışını. Foton saçılma ve emilimi ile daha büyük ve kalın doku örnekleri1,3geleneksel tek aydınlatma ışını muzdarip. Çift taraflı kirişler örnek böylece şeritleme ve tek taraflı bir aydınlatma tarafından üretilen görüntüler sık görülen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Thao Nguyen ve Atsushi Nakano UCLA’dan fareler örnek görüntü sağlamak için teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışmada hibe NIH HL118650 (için Tzung K. Hsiai), HL083015 (için Tzung K. Hsiai), HD069305 (için N. C. Chi ve Tzung K. Hsiai.), HL111437 (için Tzung K. Hsiai ve N. C. Chi), HL129727 (için Tzung K. Hsiai) ve University of Texas sistemi yıldız (Juhyun için finansman tarafından desteklenen Lee).
Materials
| CW Laser | Laserglow Technologies | LMM-GBV1-PF3-00300-05 | Excitation of fluorophores |
| Neutral density filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Controls amount of light entering system |
| Achromatic beam expander | Thorlabs | GBE05-A | Expands the beam of light |
| Mechanical slit | Thorlabs | VA100C | Controls width of beam |
| Beam splitter | Thorlabs | BS013 | Forms dual-illumination beam |
| Stereo microscope with 1X objective lense | Olympus | MVX10 | Used for observation of sample |
| ORCA-Flash4.0 LT sCMOS camera | Hamamatsu Photonics | C11440-42U | Used to capture Images |
| Acrylonitrile butadiene styrene (ABS) | Stratasys | uPrint | Material used to 3-D print a sample holder |
| Fluorescent polystyrene beads | Spherotech Inc | PP-05-10 | Used for imaging system calibration |
| Borosilicate glass tubing | Corning | Pyrex 7740 | Tubing for sample embedding |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | Fill for sample chamber |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific | BP39920 | Rinse solution for mouse hearts |
| Paraformaldehyde | Electron microscopy sciences | RT-15700 | First incubation solution |
| Acrylamide | Wako Chemicals | AAL-107 | Mixed with 2,2'-Azobis dihydrochloride for second incubation solution for mouse hearts |
| 2,2'-Azobis dihydrochloride | Wako Chemicals | VA-044 | Mixed with Acrylamide for second incubation solution for mouse hearts |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma Aldrich | 71725 | Mixed with Boric acid for third incubtion solution for mouse hearts |
| Boric acid | Fischer Scientific | A74-1 | Mixed with Sodium dodecyl sulfate for third incubtion solution for mouse hearts |
| Sigma D2158 | Sigma Aldrich | D2158 | Mixed with PB, Tween-20, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | 11332465001 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Sodium azide as a refractive index matching solution |
| Sodium azide | Sigma Aldrich | S2002 | Mixed with Sigma D2158, PB, and Tween-20 as a refractive index matching solution |
| Adeno-associated virus vector 9 with a cardiac-specific Troponin T promoter tagged with GFP | Vector Biolabs | VB2045 | Expresses GFP when bound to ROMK |
| DC Servo Motor Actuator | Thorlabs | Z825B | Used for movement of sample in axial direction within light sheet |
| K-Cube Brushed DC Servo Motor Controller | Thorlabs | KDC101 | Connects to motor actuator and controls movement of the actuator |
| Amira | FEI Software | N/A | Visualization software for producing 2-D and 3-D images |
Referências
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying tissue clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Lee, J., et al. 4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Huisken, J., Stainier, D. Y. Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology. Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).
- High, F. A., Epstein, J. A. The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease. Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).
- Sachinidis, A. Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells. Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).
- Ding, Y., et al. Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution. Scientific Reports. 7, 42209 (2017).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease. Journal of Visualized Experiments. (93), e52172 (2014).
- National Heart, L., Blood Institute, . Standard Operating Procedures (SOP’s) for Duchenne Animal Models. , (2015).
- Sung, K., et al. Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping. Scientific Reports. 6, 30736 (2016).
- Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes. Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).
- FEI, . Amira User’s Guide. , 59-138 (2017).
- Gao, L., et al. Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit. Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Ding, Y., et al. Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics. JCI Insight. 2 (22), (2017).
