עקיבה ביטוי גנים דרך זיהוי של β-galactosidase פעילות ב עכבר כל העוברים
Summary
כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת העבודה פרפין חלוקתה ולא counterstaining. . זה הליך קלה ומהירה כדי לפקח על ביטוי גנים במהלך פיתוח שניתן להחילם גם על מקטעים של רקמות, איברים או תאים בתרבית.
Abstract
הגן Escherichia coli LacZ , קידוד β-galactosidase, משמש בעיקר כתב של ביטוי גנים וכן מכשיר מעקב במחקרים שושלת היוחסין התא. התגובה פתולוגיה הקלאסית מבוססת על הידרוליזה של המצע X-גל בשילוב עם יונים ferrous ו ferric, המייצרת לא מסיסים התמיסה כחול קל לדמיין. לכן, β-galactosidase פעילות משמשת כסמן את דפוס ביטוי של הגן עניין בפיתוח מתקדם. כאן נתאר הפרוטוקול הסטנדרטי איתור פעילות β-galactosidase מוקדם העכבר כל העוברים ואת שיטת עוקבות עבור פרפין חלוקתה ולא counterstaining. בנוסף, הליך שהבהרת כל העוברים מסופק משופרת של X-גל צביעת אזורים עמוקים יותר של העובר. תוצאות עקביות מתקבלים על ידי ביצוע הליך זה, למרות אופטימיזציה של תנאי ריאקציה יש צורך למזער את פעילות ברקע. מגבלות וזמינותו גם להתייחס, במיוחד לגבי הגודל של העובר מכתים כל הר. פרוטוקול שלנו מספק רגיש, שיטה אמינה לגילוי β-galactosidase במהלך פיתוח העכבר שניתן להחיל עוד סעיפים cryostat, כמו גם כל האיברים. לפיכך, דפוסי ביטוי גנים דינמי במהלך הפיתוח ניתן לנתח בקלות על-ידי שימוש בפרוטוקול זה כל העוברים, אך גם ביטוי מפורט ברמה התאית יכול להידרש לאחר חלוקתה פרפין.
Introduction
כדי לתאר דפוסי ביטוי גנים ספציפיים, השימוש של הכתב גנים כסמני כבר ביותר מדרוזופילה . יונקים. בניסויים המערבים הטרנסגניים ובעלי נוקאאוט, הגן β-galactosidase חיידקי (LacZ) של Escherichia coli (e. coli) הוא אחד בשימוש נרחב ביותר1,2,3, 4. β-galactosidase (β-גל) ה מזרז הידרוליזה של β-galactosides (כגון לקטוז) לתוך שלו monosaccharides (גלוקוז, גלקטוז)5. המצע הנפוץ ביותר שלה הוא X-גל (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), גליקוזיד זה hydrolyzed מאת β-galactosidase והוליד 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole וגלקטוז. הראשון הוא מחומצן לתוך דיימר, בעת שימוש בשילוב עם אשלגן פרי-פרו-ציאניד, מייצרת של מאפיין לא מסיס, צבע כחול לזרז (איור 1)6.
הגן LacZ התחיל לשמש גן כתב לפני למעלה משלושים שנה7,8. בדרך כלל, מוכנס LacZ במורד הזרם של יזם אנדוגני במקום מסגרת קריאה פתוחה, אז זה יכול לשמש בתרבות בקטריאלי ותא להמחיש תאים המכילים של הוספה מסוים, כמו גם בבעלי חיים הטרנסגניים מכשיר מעקב של אנדוגני ג’ין תבניות ביטוי במהלך פיתוח9. בהקשר זה, החזיית β-galactosidase פעילות יש נעשה שימוש נרחב דרוזופילה להבין את התהליכים התפתחותית וסלולריות של תאים בודדים כל רקמות. דרוזופילה גנטיקה טובה הדור של קווים יציב שבו בונה P-אלמנט שונה המכיל את גן מדווח ש-lacz הוא מוכנס באופן אקראי מיקומים הגנום. לכן, כאשר מניחים תחת השפעת משפר אלמנטים זה ייתכן להסיע הביטוי שלה בצורה רקמות ספציפיות, אשר איפשר ניתוח שיטתי של דפוסי ביטוי של גנים רבים במהלך שני העשורים האחרונים10. בנוסף, השימוש של העכברים הטרנסגניים כדי לפקח על ביטוי גנים LacZ גם מאפשר זיהוי של גן אירועים רקומבינציה לפי Cre-loxP מתווכת רקומבינציה, לוקליזציה של נגזרות מוטציה בתאי גזע עובריים בניתוח chimeric 11, אשר מקלה על השליטה של LacZ ביטוי ברקמות ספציפיות כמו גם חנותם. כמו כן, בתוך כל העוברים, זיהוי של הפעילות β-galactosidase עשויה לייצר דיפרנציאלית מוכתמים דפוסי בעוצמות שונות, זה יכול להיות שנצפו בנוחות על פני שלבים התפתחותיים שונים כדי לנתח טמפורלית שינויים בביטוי הגנים 8,12.
במאמר זה, נציג פרוטוקול להמחיש ביטוי גנים דרך X-גל מכתים ברקמה הר שלם בשלבים התפתחותיים מוקדם של העכבר עוברי. אנו מציגים בשיטה זו פתולוגיה כמו טכניקה מאוד רגיש וזולה טובות איתור מדויק של התאים עם תוויות דגימות הר שלם או ברמה התאית לאחר פרפין מוטבע רקמות או עוברי. השיטה מאפשרת פריט חזותי ישיר מכתים ברקמה עכבר עם הרקע המינימלי כאשר לעומת שיטות אחרות13.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגן LacZ e. coli כבר בשימוש נרחב בשל רגישות גבוהה קלות לזיהוי ככתב במחקרים דפוסי ביטוי גנים. בפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה קלאסית לגילוי β-גל ביטוי בהתאם לתגובה אנזימטי זה קל ומהיר לביצוע כמו גם זול. בשיטה זו ניתן ליישם גם בלי שינויים הר כל העוברים, איברים שלמים, מקטעי רקמת cryostat או תאים בתרבית.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות השירות Histopathological לסיוע טכני שלהם ב- Cardiovasculares סנטרו נאסיונאל דה Investigaciones (CNIC). אנו מודים גם ד ר Seiki מוטוהארא עבור עכברים Mt4-mmpLacZ מתן בחביבות, ד ר אליסיה ג’י ארויו עבור תמיכה הפרויקט שלנו ועבור שלה קריאה ביקורתית של כתב היד. אנחנו רוצים להודות פיטר בוני להגהת מאמר זה. עבודה זו נתמך על ידי אוניברסיטת Europea דה מדריד באמצעות מענק (# 2017UEM01) הוענק C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
