Spåra genuttryck genom påvisande av β-galaktosidas aktivitet i hela musembryon
Summary
Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och metoden för paraffin snittning och counterstaining. Detta är en enkel och snabb procedur för att övervaka genuttryck under utveckling som kan också tillämpas på vävnadssnitt, organ eller odlade celler.
Abstract
Escherichia coli Lindholm genen, kodning β-galaktosidas, används i stor utsträckning som reporter för genuttryck och som spårämne i cellstudier härstamning. Klassiskt histochemical reaktionen baseras på hydrolys av substratet X-gal i kombination med järnklorid och järn joner, som producerar en olöslig blå fällningen som är lätt att visualisera. Därför, β-galaktosidas aktivitet fungerar som en markör för uttrycksmönstret av genen av intresse som utvecklingen fortsätter. Här beskriver vi standardprotokollet för detektion av β-galaktosidas aktivitet i tidig hela musembryon och efterföljande metoden för paraffin snittning och counterstaining. Dessutom föreskrivs ett förfarande för att klargöra hela embryon att bättre visualisera X-gal färgning i djupare regioner av embryot. Konsekventa resultat erhålls genom att utföra proceduren, även om optimering av reaktion villkor behövs för att minimera bakgrund aktivitet. Begränsningar i analysen bör också övervägas, särskilt när det gäller storleken på embryot i hela mount färgning. Våra protokollet ger en känslig och en pålitlig metod för β-galaktosidas upptäckt under musen utvecklingen som ytterligare kan tillämpas på de kryostaten sektioner samt hela organ. Således de dynamiska gen uttryck mönsterna i hela utveckling kan enkelt analyseras med hjälp av detta protokoll i hela embryon, men också detaljerade uttryck på cellulär nivå kan bedömas efter paraffin snittning.
Introduction
För att beskriva specifik gen uttrycksmönster, har användning av reporter gener som markörer varit avgörande från Drosophila till däggdjur. I experiment med genmanipulerad och knockout djur, är bakteriell β-galaktosidas genen (Lindholm) av Escherichia coli (E. coli) en av de mest använda1,2,3, 4. β-galaktosidas (β-gal) katalyserar hydrolys av β-galactosides (t.ex. laktos) till dess monosackarider (glukos och galaktos)5. Dess vanligaste substrat är X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), en glykosid som hydrolyseras av β-galaktosidas som ger upphov till 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole och galaktos. Först oxideras till en dimer som, när den används i kombination med kalium-ferri- och ferro-cyanid, producerar en karakteristisk olösligt, blå färg fällningen (figur 1)6.
Lindholm genen börjat användas som en reporter gen över trettio år sedan7,8. Vanligtvis, Lindholm infogas nedströms en endogen arrangören i stället för öppen läsning ramen, så den kan användas i bakteriell och cell kultur att visualisera celler som innehåller en viss insats, liksom i transgena djur som spårämne av endogen gen uttrycksmönster under utveckling9. I detta avseende har visualisering av β-galaktosidas aktivitet flitigt använts i Drosophila för att förstå de utvecklingsmässiga och cellulära processerna från enstaka celler till hela vävnader. Drosophila genetik för generering av stabila linjer där en modifierad P-element konstruktion innehållande reporter genen Lindholm är insatt på måfå platser i genomet. Således, när placeras under inflytande av enhancer element kan det driva sitt uttryck på ett särskilt sätt för vävnad, som har möjliggjort en systematisk analys av uttrycksmönster av många gener under de senaste två decennier10. Användningen av transgena möss att övervaka Lindholm genuttryck kan dessutom också upptäckt genen rekombination händelser av Cre-loxP medierad rekombination och lokalisering av muterade embryonala stamceller derivat i chimära analyser 11, som underlättar kontroll av Lindholm uttryck i specifika vävnader samt som temporally. Dessutom i hela embryon, kan upptäckt av β-galaktosidas aktiviteten producera differentiell färgning mönster vid olika intensiteter som bekvämt kan observeras över olika utvecklingsstadier att analysera tidsmässiga förändringar i genuttryck 8,12.
I denna artikel presenterar vi ett protokoll för att visualisera genuttryck genom X-gal färgning i hela mount vävnaden i tidiga utvecklingsstadier av musembryon. Vi presenterar denna histochemical metod som en mycket känslig och billig teknik som gynnar korrekt upptäckt av märkta celler i hela mount exemplar eller på cellnivå efter paraffin inbäddat vävnader eller embryon. Metoden möjliggör direkt visualisering av färgning i mus vävnaden med minsta bakgrunden jämfört med andra metoder13.
Protocol
Representative Results
Discussion
E. coli Lindholm genen har använts som reporter i studier av gen uttrycksmönster på grund av dess höga känslighet och underlätta identifiering. Protokolls beskriver en klassisk metod för att upptäcka β-gal uttryck baserat på en enzymatisk reaktion som är enkel och snabb att utföra samt billig. Denna metod kan användas även utan större modifieringar i hela mount embryon, intakta organ, kryostaten vävnadssnitt eller odlade celler.
Korrekt tillämpning av denna metod resu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka histopatologiska tjänsten för deras tekniskt bistånd på de Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Vi tackar också Dr Motoharu Seiki för vänligt ge Mt4-mmpLindholm möss och Dr Alicia G. Arroyo för att stödja vårt projekt och för hennes kritisk läsning av manuskriptet. Vi vill tacka Peter Bonney för korrekturläsning denna artikel. Detta arbete stöds av Universidad Europea de Madrid med hjälp av ett bidrag (# 2017UEM01) till C.S.C.
Materials
| REAGENTS | |||
| 2-Propanol | SIGMA-ALDRICH | 24137-1L-R | |
| Agarose | SCHARLAU | 50004/ LE3Q2014 | |
| Aqueous mounting medium | VECTOR LABS | H-5501 | |
| Synthetic mounting media | MERCK | 100579 | |
| 96% Ethanol | PROLABO | 20824365 | |
| 99.9% Ethanol absolute | SCHARLAU | ET00021000 | |
| 50% Glutaraldehyde solution | SIGMA-ALDRICH | G6403-100ml | |
| 85% Glycerol | MERCK | 104094 | |
| 99.9% Glycerol | SIGMA-ALDRICH | G5516 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | SIGMA-ALDRICH | 63064 | |
| Nonionic surfactant (Nonidet P-40) | SIGMA-ALDRICH | 542334 | |
| Nuclear Fast Red counterstain | SIGMA-ALDRICH | N3020 | |
| Paraffin pastilles | MERCK | 111609 | |
| Paraformaldehyde | SIGMA-ALDRICH | 158127-500g | |
| Phosphate buffered saline (tablets) | SIGMA-ALDRICH | P4417-50TAB | |
| Potassium ferrocyanate | MERCK | 1049840500 | |
| Potassium ferrocyanide | MERCK | 1049731000 | |
| Sodium azide | SIGMA-ALDRICH | S8032 | |
| Sodium deoxycholate | SIGMA-ALDRICH | 30970 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | SIGMA-ALDRICH | 106346 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate | SIGMA-ALDRICH | 71638 | |
| Thymol | SIGMA-ALDRICH | T0501 | |
| Tris hydrochloride (Tris HCl) | SIGMA-ALDRICH | 10812846001 (Roche) | |
| X-GAL | VENN NOVA | R-0004-1000 | |
| Xylene | VWR CHEMICALS | VWRC28973.363 | |
| EQUIPMENT | |||
| Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm | SAKURA | 4566 | |
| Rotatory Microtome | Leica | RM2235 | |
| Cassettes | Oxford Trade | OT-10-9046 | |
| Microscope Cover Glasses 24×60 mm | VWR | ECN631-1575 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | AGAA000001#12E | |
| Adhesion microscope slides | Thermo Scientific, MENZEL-GLÄSER | J1820AMNZ | |
| Flotation Water bath | Leica | HI1210 | |
| Disposable Low Profile Microtome Blades | Feather | UDM-R35 | |
| Paraffin oven | J.R. SELECTA | 2000205 | |
| Wax Paraffin dispenser | J.R. SELECTA | 4000490 | |
| Stereomicroscope | Leica | DM500 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL | SIGMA-ALDRICH | T2795 | |
| Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL | SIGMA-ALDRICH | T9661 | |
| Orbital shaker | IKA Labortechnik | HS250 BASIC | |
| Stirring Hot Plate | Bibby | HB502 | |
| Vortex Shaker | IKA Labortechnik | MS1 | |
| Laboratory scale | GRAM | FH-2000 | |
| Precision scale | Sartorius | ISO9001 | |
| pHmeter | Crison | Basic 20 | |
| Optic fiber | Optech | PL2000 |
References
- Shuman, H. A., Silhavy, T. J., Beckwith, J. R. Labeling of proteins with beta-galactosidase by gene fusion. Identification of a cytoplasmic membrane component of the Escherichia coli maltose transport system. The Journal of Biological Chemistry. 255, 168-174 (1980).
- Cui, C., Wani, M. A., Wight, D., Kopchick, J., Stambrook, P. J. Reporter genes in transgenic mice. Transgenic Research. 3, 182 (1994).
- Takahashi, E., et al. Expression analysis of Escherichia coli lacZ reporter gene in transgenic mice. Brain Research. Brain Research Protocols. 5 (2), 159-166 (2000).
- Burn, S. F. Detection of β-Galactosidase Activity: X-gal Staining. Methods Mol Biol. 886, 241-250 (2012).
- Jacob, F., Monod, J. Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins. J Mol Biol. 3, 318-356 (1961).
- Pearson, B., Wolf, P. L., Vazquez, J. A comparative study of a series of new indolyl compounds to localize beta-galactosidase in tissues. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 12, 1249-1259 (1963).
- Kothary, R., et al. A transgene containing lacZ inserted into the dystonia locus is expressed in neural tube. Nature. 335 (6189), 435-437 (1988).
- Kothary, R., et al. Inducible expression of an hsp68-lacZ hybrid gene in transgenic mice. Development. 105 (4), 707-714 (1989).
- Blanco, M. J., et al. Developmental expression of membrane type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp/Mmp17) in the mouse embryo. PLOS ONE. 12 (9), e0184767 (2017).
- Hartenstein, V., Jan, Y. N. Studying Drosophila embryogenesis with P-lacZ enhancer trap lines. Roux’s Archives of Developmental Biology. 201 (4), 194-220 (1992).
- Gierut, J. J., Jacks, T. E., Haigis, K. M. Whole-mount X-Gal staining of mouse tissues. Cold Spring Harb Protoc. 1 (4), 417-419 (2014).
- Cooper, M. A., Zhou, R. β-Galactosidase Staining of LacZ Fusion Proteins in Whole Tissue Preparations. Methods Mol Biol. 1018, 189-197 (2013).
- Sundararajan, S., Wakamiya, M., Behringer, R. R., Rivera-Pérez, J. A. A fast and sensitive alternative for β-galactosidase detection in mouse embryos. Development. 139 (23), 4484-4490 (2012).
- Wei, Q., Manley, N. R., Condie, B. G. Whole mount in situ hybridization of E8.5 to E11.5 mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. 56, 2797 (2011).
- Rikimaru, A., et al. Establishment of an MT4-MMP-deficient mouse strain representing an efficient tracking system for MT4-MMP/MMP-17 expression in vivo using beta-galactosidase. Genes Cells. 12 (9), 1091-1100 (2007).
- Leight, J. L., Alge, D. L., Maier, A. J., Anseth, K. S. Direct measurement of matrix metalloproteinase activity in 3D cellular microenvironments using a fluorogenic peptide substrate. Biomaterials. 34 (30), 7344-7352 (2013).
- Ma, W., Rogers, K., Zbar, B., Schmidt, L. Effects of different fixatives on β-galactosidase activity. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50 (10), 1421-1424 (2002).
- Lojda, Z. Indigogenic methods for glycosidases. II. An improved method for beta-D-galactosidase and its application to localization studies of the enzymes in the intestine and in other tissues. Histochemie. 23 (3), 266-288 (1970).
- Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. Overview and assessment of the histochemical methods and reagents for the detection of β-galactosidase activity in transgenic animals. Anat Sci Int. 91, 56-67 (2016).
- Sanchez-Ramos, J., et al. The X-gal Caution in Neural Transplantation Studies. Cell Transplantation. 9 (5), 657-667 (2000).
- Weiss, D. J., Liggitt, D., Clark, J. G. In situ histochemical detection of beta-galactosidase activity in lung: assessment of X-Gal reagent in distinguishing lacZ gene expression and endogenous beta-galactosidase activity. Hum Gene Ther. 8 (13), 1545-1554 (1997).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Schulz, A., Ricken, A. M. Comments on Methods to Suppress Endogenous β-Galactosidase Activity in Mouse Tissues Expressing the LacZ Reporter Gene. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 64 (10), 579-586 (2016).
- Buesa, R. J., Peshkov, M. V. Histology without xylene. Annals of Diagnostic Pathology. 13, 246-256 (2009).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Kandyala, R., Raghavendra, S. P. C., Rajasekharan, S. T. Xylene: An overview of its health hazards and preventive measures. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 14 (1), 1-5 (2010).
- Hinds, H. L. A Comparison of Three Xylene Substitutes. Laboratory Medicine. 17 (12), 752-755 (1986).
- Merkwitz, C., Blaschuk, O., Winkler, J., Schulz, A., Prömel, S., Ricken, A. M. Advantages and Limitations of Salmon-Gal/Tetrazolium Salt Histochemistry for the Detection of LacZ Reporter Gene Activity in Murine Epithelial Tissue. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 65 (4), 197-206 (2017).
- Levitsky, K. L., Toledo-Aral, J. J., López-Barneo, J., Villadiego, J. Direct confocal acquisition of fluorescence from X-gal staining on thick tissue sections. Scientific Reports. 3, 2937 (2013).
- Shen, X., Bao, W., Yu, W., Liang, R., Nguyen, B., Yu Liu, Y. An improved method with high sensitivity and low background in detecting low β-galactosidase expression in mouse embryos. PLoS One. 12 (5), (2017).
- Komatsu, Y., Kishigami, S., Mishina, Y. In situ Hybridization Methods for Mouse Whole Mounts and Tissue Sections with and Without Additional β-Galactosidase. Methods Mol Biol. 1092, 1-15 (2014).
- Jeong, Y., Epstein, D. J. Distinct regulators of Shh transcription in the floor plate and notochord indicate separate origins for these tissues in the mouse node. Development. 130 (16), 3891-3902 (2003).
- Eid, R., Koseki, H., Schughart, K. Analysis of LacZ reporter genes in transgenic embryos suggests the presence of several cis-acting regulatory elements in the murine Hoxb-6 gene. Developmental Dynamics. 196 (3), 205-216 (1993).
- Will, A. J., et al. Composition and dosage of a multipartite enhancer cluster control developmental expression of Ihh (Indian hedgehog). Nature Genetics. 49 (10), 1539-1545 (2017).
- Stanford, W. L., Cohn, J. B., Cordes, S. P. Gene-trap mutagenesis: past, present and beyond. Nature Reviews Genetics. 2 (10), 756-768 (2001).
- Ménoret, S., et al. lacZ transgenic rats tolerant for beta-galactosidase: recipients for gene transfer studies using lacZ as a reporter gene. Human Gene Therapy. 13 (11), 1383-1390 (2002).
- Takahashi, M., et al. Establishment of lacZ-transgenic rats: a tool for regenerative research in myocardium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 904-908 (2003).
- Mozdziak, P. E., Borwornpinyo, S., McCoy, D. W., Petitte, J. N. Development of transgenic chickens expressing bacterial betagalactosidase. Developmental Dynamics. 226 (3), 439-445 (2003).
- Mozdziak, P. E., Wu, Q., Bradford, J. M., Pardue, S. L., Borwornpinyo, S., Giamario, C., Petitte, J. N. Identification of the lacZ insertion site and beta-galactosidase expression in transgenic chickens. Cell Tissue Research. 324 (1), 41-53 (2006).
- Hartley, K. O., Nutt, S. L., Amaya, E. Targeted gene expression in transgenic Xenopus using the binary Gal4-UAS system. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 99, 1377-1382 (2002).
- Scheer, N., Campos-Ortega, J. A. Use of the Gal4-UAS technique for targeted gene expression in the zebrafish. Mechanisms of Development. 80 (2), 153-158 (1999).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Lee, B. Y., et al. Senescence-associated beta-galactosidase is lysosomal beta-galactosidase. Aging Cell. 5 (2), 187-195 (2006).
- Morais, K. S., Guimarães, A. F. R., Ramos, D. A. R., Silva, F. P., de Oliveira, D. M. Long-term exposure to MST-312 leads to telomerase reverse transcriptase overexpression in MCF-7 breast cancer cells. Anti-Cancer Drugs. 28 (7), 750-756 (2017).
- Dimri, G. P., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 92 (20), 9363-9367 (1995).
