JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

Definere Hsp33's Redox regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging Conformational endringer på Hsp33 med Hydrogen-deuterium Exchange massespektrometri

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

En av de mest utfordrende stress forholdene som organismer møte under sin levetid innebærer akkumulering av oksidanter. Under oksidativt stress avhengige celler tungt molekylær chaperones. Her presenterer vi metoder brukes til å undersøke redoks regulert anti-aggregering aktiviteten, samt for å overvåke strukturendringer styrer funksjonen Anstandsdame bruker HDX-MS.

Abstract

Levende organismer må regelmessig takle varierende miljøer i løpet av livssyklusen, inkludert endringer i temperatur, pH, akkumulering av frie radikaler og mer. Disse svingningene kan føre til en utbredt protein unfolding, aggregering, og celle død. Derfor har celler utviklet et dynamisk og stress-spesifikke nettverk av molekylære chaperones, som opprettholde en “sunn” proteom under stress forhold. ATP-uavhengig chaperones utgjør en stor klasse av molekylære chaperones, som fungerer som første linje forsvar molekyler, beskytter mot protein samling på en stress-avhengige måte. En funksjon disse chaperones har felles er deres evne til å utnytte strukturelle plastisitet for stress-spesifikke aktivisering, anerkjennelse, og utgivelsen av misfolded klienten.

I dette papiret fokuserer vi på funksjonelle og strukturelle analysen av en slik egentlig uordnede Anstandsdame, bakteriell redoks regulert Hsp33, som beskytter proteiner mot aggregering under oksidativt stress. Her presenterer vi en verktøykasse ulike teknikker for å studere redoks regulert Anstandsdame aktivitet og kartlegging conformational endringer av Anstandsdame, underliggende sin virksomhet. Spesielt vi beskrive en arbeidsflyt som inkluderer utarbeidelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner, etterfulgt av en analyse av Anstandsdame anti-aggregering aktivitet i vitro bruker lys-spredning, med fokus på graden av den anti-aggregering aktivitet og dens kinetics. For å overvinne hyppige outliers akkumulert under aggregasjon analyser, beskriver vi bruken av Kfits, en ny grafisk verktøyet hvilke innrømmer enkel behandling av kinetic målinger. Dette verktøyet kan lett brukes på andre typer kinetic mål for fjerne outliers og passende kinetic parametere. Til relatere funksjonen med proteinstruktur, beskriver vi oppsett og arbeidsflyten en strukturell massespektrometri teknikk, hydrogen-deuterium exchange massespektrometri, som tillater kartlegging av conformational endringer på Anstandsdame og substrat under ulike stadier av Hsp33 aktivitet. Av samme metode kan brukes på andre protein-protein og protein-ligand interaksjoner.

Introduction

Celler støter ofte en opphopning av reaktive oksygen arter (ROS) som biprodukter åndedrett1,2, protein, lipid oksidasjon3,4og tilleggsprosesser5, 6,7. Til tross for ROS’ fordelaktige rolle i ulike biologiske prosesser som cellular signal8,9 og immunrespons10, kan en ubalanse mellom ROS produksjon og dens avgiftning oppstå, fører til oksidativt understreke7. Biologiske mål for ROS er proteiner og lipider nucleic syrer, oksidasjon som påvirker deres struktur og funksjon. Derfor er akkumulering av mobilnettet oksidanter sterkt knyttet til en rekke ulike patologi inkludert kreft9,11, betennelse12,13og aldring14, 15, og har blitt funnet for å være involvert i starten og progresjon av nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers, Parkinsons og ALS sykdom16,17,18.

Både nylig syntetisert og modne proteiner er svært følsom for oksidasjon på grunn av de potensielt skadelige endringene av deres side kjeder, som forme proteiner struktur og funksjon19,20. Derfor fører oksidativt stress vanligvis til en utbredt protein inaktivering, misfolding og aggregering, til slutt fører til celledød. En av de elegante mobilnettet strategiene for å takle den potensielle skaden av protein oksidasjon er å benytte redoks-avhengige chaperones, som hemmer utbredt protein aggregering, i stedet for danner stabile kompleksene med misfolded klient proteiner21 ,22,23. Disse første linje forsvar chaperones aktiveres raskt som en områdespesifikk oksidasjon (vanligvis på cystein rester) at de konverteres til potent anti-aggregering molekyler24. Siden oksidativt stress resulterer i Hemming av åndedrett og nedgang i mobilnettet ATP nivåer25, er Kanonisk ATP-avhengige chaperones mindre effektive under oksidativt stress forhold25,26 ,27. Derfor redoks-aktivert ATP-uavhengig chaperones spiller en viktig rolle i å opprettholde protein homeostase ved akkumulering av oksidanter bakterier og eukaryoter (f.eks, Hsp3328 og RidA29 i bakterier, Get330 i gjær, peroxiredoxins31 i eukaryoter). Aktiviteten til disse chaperones avhenger sterkt reversibel strukturelle conformational forandringer indusert av en områdespesifikk oksidasjon som avdekker hydrofobe regioner involvert i anerkjennelse av misfolded klient proteiner.

Forskning av anti-aggregering mekanismen og prinsipper anerkjennelse av klienten proteiner av chaperones er ikke lett på grunn av dynamisk og heterogenic natur Anstandsdame-underlaget interaksjoner32,33, 34,35,36,37. Men stress regulert chaperones har en mulighet til å fremme vår forståelse av funksjonen anti-aggregering evne til å: 1) få to ulike former av Anstandsdame, aktiv (f.eksoksidert) og inaktiv (f.eks redusert), med introduksjon eller fjerning av en belastning enkelt bytte mellom dem (f.eks, oksiderende og redusere agent), 2) har en rekke forskjellige underlag, 3) utgjør svært stabile kompleksene med klienten proteiner som kan bli vurdert av ulike strukturelle metoder og 4) fokusere utelukkende på underlaget anerkjennelse og utgivelse, formidlet av redoks-avhengige conformational endringer, som fleste av disse chaperones mangler folding evnen.

Her analyserer vi den bakterielle redoks regulert Anstandsdame Hsp33’s anti-aggregering aktivitet, en viktig komponent i den bakterielle forsvar mot oksidering-indusert protein aggregering28. Når redusert, er Hsp33 et tett foldet sink-bindende protein uten Anstandsdame aktivitet; imidlertid utsettes for oksidativt stress, gjennomgår Hsp33 omfattende conformational endringer som utsetter sin substrat bindende områder38,39. Ved oksidasjon er sink ion som er sterkt bundet til fire høyt konservert cystein rester av C-terminalen domenet utgitt40. Dette resulterer i dannelsen av to disulfide obligasjoner, en utfoldelse av C-terminalen domenet, og en destabilisering av de tilstøtende koblingsfunksjonalitet region41. Regionene C-terminalen og linker er svært fleksibel og er definert som egentlig eller delvis disordered. Ved retur til ikke forhold, cysteinene blir redusert og Anstandsdame tilbake til sin opprinnelige brettet tilstand uten anti-aggregering aktivitet. Refolding av Anstandsdame fører til en ytterligere unfolding og destabilization bundet klient protein, som utløser overtatt kanoniske Anstandsdame systemet, DnaK/J, for refolding38. Analyse av Hsp33’s samhandling nettsteder antyder at Hsp33 benytter både sin ladet uordnede områder samt hydrofobe regionene på linker og N-terminal domene å fange misfolded klient proteiner og hindre deres aggregering38, 42. i foldet staten, disse områdene er skjult av brettet linker og C-terminalen domene. Interessant, fungerer regionen koblingsfunksjonalitet som en gatekeeper av Hsp33’s foldet og inaktiv tilstand, “sensing” folding statusen sin ved C-terminalen domene34. Når ustabil av mutagenese (enten en punkt mutasjon eller en full sekvens forstyrrelsene), konverteres Hsp33 til en constitutively aktive Anstandsdame uansett redoks staten sin redoks-sensitive cysteinene43.

Protokollene presenteres her tillate overvåking av Hsp33’s redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet, samt kartlegging conformational endringer på aktivering og bindende klient proteiner. Denne metoden kan tilpasses til forskning andre Anstandsdame-klienten godkjenning modeller så vel som ikke-Anstandsdame protein-protein interaksjoner. Dessuten, presenterer vi protokoller for utarbeidelse av fullt redusert og oksidert chaperones som kan brukes i studier av andre redoks-bryteren proteiner, for å avsløre potensielle roller av protein oksidasjon på protein aktiviteten.

Spesielt vi beskriver en prosedyre for å overvåke Anstandsdame aktivitet i vitro og definere sine substrat spesifisitet under ulike typer protein aggregasjon (kjemisk eller termisk indusert) bruker lysspredning (LS) målt ved en fluorospectrometer44. Under aggregering, spredning lys på 360 nm øker raskt på grunn av den økende turbiditet. Dermed overvåkes aggregering i en tidsavhengige måte på denne bølgelengde. LS er en rask og følsom metode for protein aggregering og dermed anti-aggregering aktiviteten til et protein rundt med nanomolar konsentrasjoner, aktivere karakterisering av protein aggregering-relaterte kinetic parametere under forskjellige forhold. Videre LS protokollen beskrevet her krever ikke dyrt instrumentering, og lett kan opprettes i et laboratorium.

Likevel er det ganske utfordrende å få “ren” kinetic kurver og utlede et protein kinetic parametere fra slike lys spredning eksperimenter, støy og det store antallet outliers luftbobler og store mengder. For å overvinne denne hindringen, presenterer vi en ny grafisk verktøy, Kfits45, brukes for å redusere støy i ulike kinetic målinger, spesielt utstyrt for protein aggregering kinetic data. Denne programvaren gir foreløpige kinetic parametere for en tidlig vurdering av resultatene og lar brukeren “ren” store datamengder raskt uten å påvirke egenskapene kinetic. Kfits er implementert i Python og tilgjengelig i åpen kildekode 45.

En av de utfordrende spørsmålene i feltet gjelder kartlegging samhandling områder mellom chaperones og deres klient proteiner og forstå hvordan chaperones gjenkjenner en rekke misfolded underlag. Dette spørsmålet er mer komplisert når studere svært dynamisk protein komplekser som involverer egentlig disordered chaperones og aggregering utsatt underlag. Heldigvis strukturelle massespektrometri har dramatisk avansert det siste tiåret, og har klart å gi nyttige metoder og verktøy for å analysere strukturelle plastisitet og tilordne rester involvert i protein anerkjennelse46, 47 , 48 , 49. Her presenterer vi en slik teknikk-hydrogen-deuterium exchange massespektrometri (HDX-MS)-som tillater kartlegging av rester nivå endringer i en strukturell konformasjon ved protein endring eller protein/Ligand binding35, 50,,51,,52,,53,,54,,55. HDX-MS bruker kontinuerlig utveksling av ryggraden bygget av deuterium, frekvensen som påvirkes av kjemiske miljøet, tilgjengelighet og kovalente og ikke-kovalente bindinger56. HDX-MS sporer prosessene exchange bruker et deuterated løsemiddel, vanligvis tungtvann (D2O), og lar målingen basert på endringen i molekylvekt etter hydrogen deuterium Exchange. Lavere priser på hydrogen-deuterium exchange kan resultere fra bygget deltar i hydrogenbindinger, eller bare fra steric hinder, som angir lokale endringer i strukturen57. Endre på en ligand binding eller post-translasjonell modifikasjoner kan også føre til forskjeller i hydrogen miljø, med en binding som resulterer i forskjeller i hydrogen-deuterium exchange (HDX) priser46,53.

Vi brukt denne teknologien til 1) Hsp33 kartregioner som raskt utvikler seg ved oksidasjon, fører til aktivering av Hsp33, og 2) definerer potensielle bindende grensesnittet av Hsp33 med sin fulle misfolded underlaget, citrate syntase (CS)38.

Metodene som er beskrevet i dette manuskriptet kan brukes for å studere redoks-avhengige funksjoner proteinene i vitro, definere anti-aggregering aktivitet og rollen til strukturelle endringer (hvis noen) i protein-funksjonen. Disse metodene kan lett tilpasses ulike biologiske systemer og brukes i laboratoriet.

Protocol

1. forberedelse av fullt redusert og fullstendig oksidert proteiner Utarbeidelse av en fullt redusert proteinMerk: Her beskriver vi reduksjon av sink inneholder protein og bruke en ZnCl2 løsning gjenopprettet Zn-innlemmet, redusert protein. ZnCl2 løsningen kan være erstattet eller forkastet. Merk at tid og temperatur av reduksjon avhenger av protein stabilitet og funksjon, og er dermed bestemte per protein. Tine protein prøven på is og spinn ned Fjern opp…

Representative Results

De to metodene presentert gjør det mulig å følge den krevende aktivitet og dynamikken i protein interaksjoner mellom en Anstandsdame og dens substrat. Videre gjør reduksjon-oksidasjon protokollen at utarbeidelsen av en fullt redusert og fullstendig oksidert Anstandsdame, gir en mer grundig forståelse av aktivisering mekanisme redoks-avhengige uordnede chaperones. Først brukte vi lysspredning undersøke redoks-avhengige akt…

Discussion

I dette papiret gitt vi protokoller for analyse av redoks-avhengige Anstandsdame aktivitet og karakterisering av strukturelle endringer ved binding av en klient protein. Dette er supplerende metoder å definere potensielle Anstandsdame-underlaget komplekser og analysere potensielle samhandling områder.

Her brukt vi disse protokollene for karakterisering av en kompleks mellom redoks regulert Anstandsdame Hsp33 med et godt studert Anstandsdame substrat CS. Vi presentert to ulike typer protein a…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne er takknemlig å Meytal Radzinski for hennes nyttig diskusjoner og kritisk lesing av artikkelen og Patrick Griffin og hans lab medlemmer for deres ubegrenset hjelp ved opprettelse HDX analyse plattform. Forfatterne er takknemlig for den tysk-Israel Foundation (I-2332-1149.9/2012), den Binational Science Foundation (2015056), Marie Curie integrering tilskudd (618806), Israel Science Foundation (1765/13 og 2629/16), og den menneskelige Frontier vitenskap Programmet (CDA00064/2014) for deres støtte.

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. Journal of Biological Chemistry. 292 (41), 16804-16809 (2017).
  2. Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochemical Journal. 417 (1), 1-13 (2009).
  3. Walker, C. L., Pomatto, L. C. D., Tripathi, D. N., Davies, K. J. A. Redox regulation of homeostasis and proteostasis in peroxisomes. Physiological Reviews. 98 (1), 89-115 (2018).
  4. Hohn, A., Konig, J., Jung, T. Metabolic syndrome, redox state, and the proteasomal system. Antioxidants & Redox Signaling. 25 (16), 902-917 (2016).
  5. Holmstrom, K. M., Finkel, T. Cellular mechanisms and physiological consequences of redox-dependent signalling. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 411-421 (2014).
  6. Halliwell, B., Gutteridge, J. M. C. . Free radicals in biology and medicine. , (2007).
  7. He, L., et al. Antioxidants maintain cellular redox homeostasis by elimination of reactive oxygen species. Cellular Physiology and Biochemistry: International Journal of Experimental Cellular Physiology, Biochemistry, and Pharmacology. 44 (2), 532-553 (2017).
  8. Bae, Y. S., Oh, H., Rhee, S. G., Yoo, Y. D. Regulation of reactive oxygen species generation in cell signaling. Molecules and Cells. 32 (6), 491-509 (2011).
  9. Giles, G. I. The redox regulation of thiol dependent signaling pathways in cancer. Current Pharmaceutical Design. 12 (34), 4427-4443 (2006).
  10. Qiao, J., et al. Regulation of platelet activation and thrombus formation by reactive oxygen species. Redox Biology. 14, 126-130 (2018).
  11. Milkovic, L., Siems, W., Siems, R., Zarkovic, N. Oxidative stress and antioxidants in carcinogenesis and integrative therapy of cancer. Current Pharmaceutical Design. 20 (42), 6529-6542 (2014).
  12. Duecker, R., et al. Oxidative stress-driven pulmonary inflammation and fibrosis in a mouse model of human ataxia-telangiectasia. Redox Biology. 14, 645-655 (2018).
  13. Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxidants & Redox Signaling. 18 (6), 642-660 (2013).
  14. Jones, D. P. Redox theory of aging. Redox Biology. 5, 71-79 (2015).
  15. Labunskyy, V. M., Gladyshev, V. N. Role of reactive oxygen species-mediated signaling in aging. Antioxidants & Redox Signaling. 19 (12), 1362-1372 (2013).
  16. Kurian, P., Obisesan, T. O., Craddock, T. J. A. Oxidative species-induced excitonic transport in tubulin aromatic networks: potential implications for neurodegenerative disease. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 175, 109-124 (2017).
  17. Marinelli, P., et al. A single cysteine post-translational oxidation suffices to compromise globular proteins kinetic stability and promote amyloid formation. Redox Biology. 14, 566-575 (2018).
  18. Bozzo, F., Mirra, A., Carrì, M. T. Oxidative stress and mitochondrial damage in the pathogenesis of ALS: new perspectives. Neuroscience Letters. 636, 3-8 (2017).
  19. Lo Conte, M., Carroll, K. S. The redox biochemistry of protein sulfenylation and sulfinylation. Journal of Biological Chemistry. 288 (37), 26480-26488 (2013).
  20. Reichmann, D., Jakob, U. The roles of conditional disorder in redox proteins. Current Opinion in Structural Biology. 23 (3), 436-442 (2013).
  21. Suss, O., Reichmann, D. Protein plasticity underlines activation and function of ATP-independent chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 43 (2015).
  22. Voth, W., Jakob, U. Stress-activated chaperones: a first line of defense. Trends in Biochemical Sciences. 42 (11), 899-913 (2017).
  23. Segal, N., Shapira, M. HSP33 in eukaryotes – an evolutionary tale of a chaperone adapted to photosynthetic organisms. The Plant Journal. 82 (5), 850-860 (2015).
  24. Dahl, J. U., Gray, M. J., Jakob, U. Protein quality control under oxidative stress conditions. Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).
  25. Winter, J., Linke, K., Jatzek, A., Jakob, U. Severe oxidative stress causes inactivation of DnaK and activation of the redox-regulated chaperone Hsp33. Molecular Cell. 17 (3), 381-392 (2005).
  26. Wang, J., Sevier, C. S. Formation and reversibility of BiP protein cysteine oxidation facilitate cell survival during and post oxidative stress. Journal of Biological Chemistry. 291 (14), 7541-7557 (2016).
  27. Zhang, H., et al. Glutathionylation of the bacterial Hsp70 chaperone DnaK provides a link between oxidative stress and the heat shock response. Journal of Biological Chemistry. 291 (13), 6967-6981 (2016).
  28. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. Chaperone activity with a redox switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  29. Muller, A., et al. Activation of RidA chaperone function by N-chlorination. Nature Communications. 5, 5804 (2014).
  30. Voth, W., et al. The protein targeting factor Get3 functions as ATP-independent chaperone under oxidative stress conditions. Molecular Cell. 56 (1), 116-127 (2014).
  31. Moon, J. C., et al. Oxidative stress-dependent structural and functional switching of a human 2-Cys peroxiredoxin isotype II that enhances HeLa cell resistance to H2O2-induced cell death. Journal of Biological Chemistry. 280 (31), 28775-28784 (2005).
  32. Wright, M. A., et al. Biophysical approaches for the study of interactions between molecular chaperones and protein aggregates. Chemical Communications. 51 (51), 14425-14434 (2015).
  33. Haslbeck, M., Vierling, E. A first line of stress defense: small heat shock proteins and their function in protein homeostasis. Journal of Molecular BIology. 427 (7), 1537-1548 (2015).
  34. Rimon, O., et al. A role of metastable regions and their connectivity in the inactivation of a redox-regulated chaperone and its inter-chaperone crosstalk. Antioxidants & Redox Signaling. 27 (15), 1252-1267 (2017).
  35. Daturpalli, S., Kniess, R. A., Lee, C. T., Mayer, M. P. Large rotation of the N-terminal domain of Hsp90 is important for interaction with some but not all client proteins. Journal of Molecular Biology. 429 (9), 1406-1423 (2017).
  36. Rist, W., Graf, C., Bukau, B., Mayer, M. P. Amide hydrogen exchange reveals conformational changes in hsp70 chaperones important for allosteric regulation. Journal of Biological Chemistry. 281 (24), 16493-16501 (2006).
  37. Koldewey, P., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A. Chaperone-client interactions: non-specificity engenders multifunctionality. Journal of Biological Chemistry. 292 (29), 12010-12017 (2017).
  38. Reichmann, D., et al. Order out of disorder: working cycle of an intrinsically unfolded chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  39. Winter, J., Ilbert, M., Graf, P. C., Ozcelik, D., Jakob, U. Bleach activates a redox-regulated chaperone by oxidative protein unfolding. Cell. 135 (4), 691-701 (2008).
  40. Jakob, U., Eser, M., Bardwell, J. C. Redox switch of Hsp33 has a novel zinc-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 275 (49), 38302-38310 (2000).
  41. Ilbert, M., et al. The redox-switch domain of Hsp33 functions as dual stress sensor. Nature Structural & Molecular Biology. 14 (6), 556-563 (2007).
  42. Groitl, B., et al. Protein unfolding as a switch from self-recognition to high-affinity client binding. Nature Communications. 7, 10357 (2016).
  43. Cremers, C. M., Reichmann, D., Hausmann, J., Ilbert, M., Jakob, U. Unfolding of metastable linker region is at the core of Hsp33 activation as a redox-regulated chaperone. Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11243-11251 (2010).
  44. Kumar, A., Mishra, S., Khan, E. Emerging methods for structural analysis of protein aggregation. Protein & Peptide Letters. 24 (4), 331-339 (2017).
  45. Rimon, O., Reichmann, D. Kfits: a software framework for fitting and cleaning outliers in kinetic measurements. Bioinformatics. 34 (1), 129-130 (2018).
  46. Percy, A. J., Rey, M., Burns, K. M., Schriemer, D. C. Probing protein interactions with hydrogen/deuterium exchange and mass spectrometry – a review. Analytica Chimica Acta. 721, 7-21 (2012).
  47. Sinz, A. Divide and conquer: cleavable cross-linkers to study protein conformation and protein-protein interactions. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (1), 33-44 (2017).
  48. Sinz, A., Arlt, C., Chorev, D., Sharon, M. Chemical cross-linking and native mass spectrometry: a fruitful combination for structural biology. Protein Science. 24 (8), 1193-1209 (2015).
  49. Schmidt, C., Beilsten-Edmands, V., Robinson, C. V. Insights into eukaryotic translation initiation from mass spectrometry of macromolecular protein assemblies. Journal of Molecular Biology. 428, 344-356 (2016).
  50. Marciano, D. P., Dharmarajan, V., Griffin, P. R. HDX-MS guided drug discovery: small molecules and biopharmaceuticals. Current Opinion in Structural Biology. 28, 105-111 (2014).
  51. Mistarz, U. H., Brown, J. M., Haselmann, K. F., Rand, K. D. Probing the binding interfaces of protein complexes using gas-phase H/D exchange mass spectrometry. Structure. 24 (2), 310-318 (2016).
  52. Harrison, R. A., Engen, J. R. Conformational insight into multi-protein signaling assemblies by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. Current Opinion in Structural Biology. 41, 187-193 (2016).
  53. Brown, K. A., Wilson, D. J. Bottom-up hydrogen deuterium exchange mass spectrometry: data analysis and interpretation. Analyst. 142 (16), 2874-2886 (2017).
  54. Vadas, O., Jenkins, M. L., Dornan, G. L., Burke, J. E. Using hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry to examine protein-membrane interactions. Methods in Enzymology. 583, 143-172 (2017).
  55. Zanphorlin, L. M., et al. Heat shock protein 90 kDa (Hsp90) has a second functional interaction site with the mitochondrial import receptor Tom70. Journal of Biological Chemistry. 291 (36), 18620-18631 (2016).
  56. Hvidt, A., Nielsen, S. O. Hydrogen exchange in proteins. Advances in Protein Chemistry. 21, 287-386 (1966).
  57. Roberts, V. A., Pique, M. E., Hsu, S., Li, S. Combining H/D exchange mass spectrometry and computational docking to derive the structure of protein-protein complexes. Bioquímica. 56 (48), 6329-6342 (2017).
  58. Pascal, B. D., et al. HDX Workbench: software for the analysis of H/D exchange MS data. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23 (9), 1512-1521 (2012).

Tags

Hsp33Chaperone ActivityHydrogen-deuterium ExchangeMass SpectrometryOxidative StressProtein AggregationProtein DynamicsEnzyme InteractionsVisual Demonstration

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image