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Bioquímica

用氢-氘交换质谱法定义 Hsp33's 氧化还原调节陪护活动和 Hsp33 映射构象变化

Published: June 07, 2018
doi:
10.3791/57806
, , ,
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Safra Campus Givat Ram,The Hebrew University of Jerusalem

Summary

生物体在其一生中遇到的最具挑战性的压力条件之一是氧化剂的积累。在氧化应激过程中, 细胞大量依赖分子伴侣。在这里, 我们介绍了用于研究氧化还原调节的抗聚集活性的方法, 以及通过海达兴-MS 来监测调节陪护功能的结构变化。

Abstract

生物体经常需要在其生命周期中应对波动的环境, 包括温度、pH 值的变化、活性氧的积累等等。这些波动可能导致广泛的蛋白质展开, 聚集和细胞死亡。因此, 细胞已经进化出一个动态和应力特异的分子伴侣网络, 在压力条件下维持一个 “健康的” 蛋白质组。ATP 独立伴侣构成了一个主要的类分子伴侣, 作为一线防御分子, 防止蛋白质聚集的压力依赖性的方式。这些伴侣共有的一个特点是, 他们有能力利用结构可塑性来错误折叠客户的压力特定的激活、识别和释放。

本文重点讨论了一种这种内在紊乱的伴侣的功能和结构分析, 即细菌氧化还原调节 Hsp33, 它在氧化应激过程中保护蛋白质不聚集。在这里, 我们提出了一个不同的技术工具箱, 研究氧化还原调节的陪护活动, 以及映射的构象变化的监护人, 其活动的基础。具体来说, 我们描述了一个工作流, 包括制备完全还原和完全氧化的蛋白质, 然后分析的伴侣抗聚集活动的体外利用光散射, 集中在程度抗聚集活性及其动力学。为了克服聚集分析过程中累积的异常现象, 我们描述了Kfits的用法, 这是一种新的图形化工具, 可以方便地处理动态测量。该工具可以很容易地应用于其他类型的动力学测量, 以消除异常和拟合动力学参数。为了使功能与蛋白质结构相关联, 我们描述了一种结构质谱技术、氢-氘交换质谱法的建立和工作流程, 该方法允许对监护人的构象变化进行映射, 并基质在 Hsp33 活动的不同阶段。同样的方法也适用于其他蛋白质和蛋白质配体的相互作用。

Introduction

细胞经常遇到活性氧的积累 (ROS) 产生作为呼吸的副产品1,2, 蛋白质和脂质氧化3,4和其他过程5, 6,7。尽管 ros 在多种生物过程中起着有益的作用, 如细胞信号8、9和免疫应答10, ros 生产与解毒之间的不平衡可能会发生, 导致氧化压力7。活性氧的生物学指标是蛋白质、脂质和核酸, 其氧化作用影响其结构和功能。因此, 细胞氧化剂的积累与多种病症有密切的联系, 包括癌症9,11, 炎症12,13, 衰老14,15, 并已发现参与神经退行性疾病的发病和进展, 如阿尔茨海默氏症, 帕金森氏症, ALS 疾病16,17,18。

新合成的和成熟的蛋白质对氧化反应高度敏感, 因为它们的侧链有可能有害的修饰, 它的形状蛋白质结构和功能19,20。因此, 氧化应激通常导致广泛的蛋白质失活, 错误折叠和聚集, 最终导致细胞死亡。一个优雅的细胞策略, 以应付潜在的损害蛋白质氧化是利用氧化还原依赖的伴侣, 这抑制了广泛的蛋白质聚集, 而不是形成稳定的配合与错误折叠客户端蛋白21 ,22,23。这些一线防御伴侣是迅速激活的现场特定氧化 (通常是半胱氨酸残留), 转化成有效的抗聚集分子24。由于氧化应激导致呼吸抑制和细胞 atp 水平下降25, 典型的 atp 依赖伴侣在氧化应激条件下的有效性较差25,26 ,27。因此, 氧化还原活化的 ATP 独立伴侣在维持蛋白质稳态的同时, 在细菌和真核生物中的氧化剂积累 (例如, 细菌中的 Hsp3328和佛罗里达29 , Get3 30) 中起着至关重要的作用.在酵母, peroxiredoxins31在真核生物)。这些伴侣的活动很大程度上取决于由特定地点的氧化引起的可逆结构构象变化, 它揭示了涉及识别错误折叠客户蛋白的疏水性区域。

基于伴侣-基质相互作用32、33的动态和异性质, 研究抗聚集机制和控制伴侣对客户蛋白质识别的原则并不容易, 34,35,36,37。然而, 受压力调节的伴侣有机会提高我们对抗聚集功能的理解, 因为他们的能力: 1) 获得两种不同形式的伴侣, 活跃 (如, 氧化) 和非活动 (例如,减少), 与引入或消除的压力条件容易切换 (例如, 氧化剂和还原剂), 2) 有广泛的基质, 3) 形成高度稳定的复合体与客户的蛋白质, 可以评估不同的结构方法, 和 4) 只专注于基板的识别和释放, 介导的氧化还原依赖性构象变化, 因为大多数这些伴侣缺乏折叠能力。

在这里, 我们分析的细菌氧化还原调节陪护 Hsp33’s 抗聚集活性, 一个重要组成部分的细菌防御系统抗氧化诱导蛋白聚集28。减少时, Hsp33 是一种紧密折叠的锌结合蛋白, 无陪护活动;然而, 当暴露在氧化应激, Hsp33 经历了广泛的构象变化, 暴露其基质结合区38,39。氧化后, 与 C 末端域四高度保守的半胱氨酸残留物密切相关的锌离子被释放40。这就导致了两个二硫化物键的形成, C 端域的展开, 以及相邻链接器区域41的不稳定。C 终端和链接器区域高度灵活, 被定义为内在的或部分无序的。当返回到非压力条件, 半胱氨酸减少, 陪护返回其本机折叠状态, 没有反聚集活动。伴侣的复性导致了束缚的顾客蛋白质的进一步展开和不稳定, 触发它的转移到规范化的伴侣系统, DnaK/J, 为复性38。对 Hsp33’s 相互作用站点的分析表明, Hsp33 使用其带电的无序区域以及链接器和 N 终端域上的疏水区域来捕获错误折叠的客户端蛋白质并防止其聚合38,42. 在折叠状态下, 这些区域由折叠链接器和 C 终端域隐藏。有趣的是, 链接器区域充当 Hsp33’s 折叠和非活动状态的看门人, “感知” 其相邻的 C 终端域34的折叠状态。一旦突变 (无论是点突变或全序列摄动), Hsp33 被转化为组成性主动陪护者, 无论其氧化还原敏感性半胱氨酸43的氧化还原状态。

这里提出的协议允许监测 Hsp33’s 氧化还原依赖的陪护活动, 以及映射构象变化的激活和结合的客户端蛋白。这种方法可以适应研究其他伴侣-客户识别模型以及非伴侣蛋白-蛋白质相互作用。此外, 我们提出了制备完全还原和氧化的伴侣的协议, 可用于其他氧化还原开关蛋白的研究, 以揭示蛋白质氧化对蛋白质活性的潜在作用。

具体来说, 我们描述了一个程序, 以监测伴侣活动的体外, 并确定其基底特异性在不同类型的蛋白质聚集 (化学或热诱导) 使用光散射 (LS) 测量的fluorospectrometer44。在聚合过程中, 由于浊度的增加, 360 nm 的光散射迅速增加。因此, 可以在这种波长上以时间依赖性的方式监视聚合。LS 是一种快速、灵敏的检测蛋白质聚集的方法, 因而利用 nanomolar 浓度对感兴趣的蛋白质进行抗聚集活性, 使蛋白质聚集相关的动力学参数在不同的条件。此外, 此处描述的 LS 协议不需要昂贵的仪器, 并且可以很容易地在任何实验室中建立。

然而, 获得 “清洁” 的动力学曲线, 并从这样的光散射实验中提取蛋白质的动力学参数是相当有挑战性的, 因为噪声和气泡和大骨料产生的大量异常点。为了克服这一障碍, 我们提出了一种新的图形工具, Kfits45, 用于降低不同的动力学测量的噪音水平, 特别适合蛋白质聚集动力学数据。该软件为早期评估结果提供了初步的动力学参数, 允许用户在不影响其动力学特性的情况下快速 “清除” 大量数据。Kfits是在 Python 中实现的, 在45的开源中可用。

这一领域的一个具有挑战性的问题是, 在伴侣和他们的客户蛋白质之间绘制相互作用的站点, 了解伴侣如何识别广泛的错误折叠基质。当研究高度动态的蛋白质复合物时, 这个问题会更加复杂, 这涉及到内在紊乱的伴侣和容易聚集的基质。幸运的是, 结构质谱在过去十年中已有了显著的进步, 并成功地提供了有用的方法和工具来分析蛋白质识别46中所涉及的结构可塑性和地图残留,47,48,49. 在这里, 我们提出一个这样的技术-氢-氘交换质谱 (海达兴)-这使得在结构构象上的残留水平的变化映射到蛋白质修饰或蛋白质/配体结合35, 50,51,52,53,54,55。海达兴-MS 使用氘的连续交换骨干氢, 其速率受化学环境、可达性和共价键和非共价键56的影响。海达兴-MS 跟踪这些交换过程使用的氘溶剂, 通常是重水 (D2O), 并允许测量的基础上分子量的变化后, 氢的氘交换。氢氘交换速率的减慢可能是氢参与氢键或简单地从空间障碍中产生的, 这表明结构57的局部变化。在配体结合或平移后修改后的变化也可能导致氢环境的差异, 具有约束力, 导致氢氘交换 (海达兴) 率的差异46,53。

我们将这项技术应用到 1) 地图 Hsp33 地区迅速展开后, 氧化, 导致活化 Hsp33, 和 2) 定义的潜在结合界面 Hsp33 与其全长错误折叠基质, 柠檬酸合酶 (CS)38。

本手稿所描述的方法可用于研究蛋白质在体外的氧化还原依赖性功能, 定义抗聚集活性和结构变化 (如有) 在蛋白质功能中的作用。这些方法可以很容易地适应不同的生物系统, 并应用于实验室。

Protocol

1. 充分还原和全氧化蛋白的制备 完全还原蛋白的制备注: 在这里, 我们描述了一个含锌蛋白的减少, 并使用 ZnCl2溶液, 以恢复锌纳入, 降低蛋白状态。可以更换或丢弃 ZnCl2解决方案。请注意, 还原过程的时间和温度取决于蛋白质的稳定性和功能, 因此每种蛋白质都是特定的。 在冰上解冻蛋白质样品, 并将其向下旋转以除去骨料。孵育样品至少1.5 小时在37°…

Representative Results

所提出的两种方法使人们有可能遵循伴侣与其基质之间蛋白质相互作用的动力学活动和动力学。此外, 还原氧化协议允许准备一个完全还原和完全氧化的伴侣, 使更深入地了解氧化还原依赖紊乱的伴侣的活化机制。 首先, 我们使用光散射, 以检查与氧化还原相关的活动的陪护。光散射是在化学和热变性 CS 蛋白存在氧化 (活跃) 或?…

Discussion

在本文中, 我们提供了分析氧化还原依赖性伴侣活动的方法, 以及对蛋白质结合后结构变化的描述。这些是补充的方法, 以确定潜在的伴侣-基质化合物和分析潜在的互动网站。

在这里, 我们应用这些协议来描述一个复杂的氧化还原调节伴侣 Hsp33 与一个良好研究的陪护基质 CS。我们提出了两种不同的蛋白质聚集分析, 它们的动力学和初始状态不同: 在化学变性过程中, 基体从变性?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

作者感谢 Meytal Radzinski 为她提供了有益的讨论和对文章的批判性阅读, 以及帕特里克格里芬及其实验室成员在建立海达兴分析平台时的无限帮助。作者感谢德国-以色列基金会 (2332-1149.9/2012)、两国科学基金会 (2015056)、玛丽-居里综合赠款 (618806)、以色列科学基金会 (1765/13 和 2629/16) 和人类前沿科学计划 (CDA00064/2014) 为他们的财政支持。

Materials

Chemicals, Reagents
Acetonitrile HPLC plus Sigma Aldrich 34998-2.5L solvent
Formic acid Optima LC/MS Fisher Chemicals A117-50 solvent supplement
Isopropyl alcohol, HPLC grade Fisher Chemicals P750717 solvent
Methanol Fisher Chemicals A456-212 solvent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich 252859 buffer
Trifluoroacetic acid Sigma Aldrich 76-05-1 solvent
Water for HPLC Sigma Aldrich 270733-2.5L-M solvent
ZnCl2, Zinc Chloride Merck B0755416 308 reagent
DTT goldbio 27565-41-9 reducing agent
PD mini trap G-25 columns GE healthcare GE healthcare 29-9180-07 desalting column
Potassium Phosphate United states Biochemical Corporation 20274 buffer
Hydrogen peroxide 30% Merck K46809910526 oxidizing agent
citrate synthase sigma aldrich C3260 substrate
HEPES acid free sigma aldrich 7365-45-9 buffer
Gndcl sigma aldrich G3272-500G denaturant
Deuterium Chloride Solution sigma aldrich 543047-10G buffer
Deuterium Oxide 99% sigma aldrich 151882-100G solvent
TCEP bioworld 42000058-2 reducing agent
150uL Micro-Insert with Mandrel Interior & Polymer Feet, 29*5mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
1.5mL Clear Short Thread Vial 9mm Thread, 11.6*32mm La-Pha-Pack -Thermo Fischer Scientific
quartz cuvette Hellma 101-QS
Instruments
Jasco FP-8500 Fluorospectrometer Jasco
Thermomixer Comfort Eppendorf 13058/0
Heraeus Megafuge 16R, bench topCentrifuge Thermo Scientific
pH meter , PB-11 sartorius Sartorius 13119/0
AffiPro Immobilized Pepsin column (20mm length, 2.0mm diameter). AffiPro
Waters Pre-column (ACQUITY UPLC BEH C18 VanGuard 130 Å, 1.7um, 2.1mmx5mm) Waters
C18 analytical column (ACQUITY UPLC Peptide BEH c18 Column, 130 Å, 1.7um, 2.1mmx50mm)
Vinyl Anaerobic chamber with Airlock door COY
Q-exactive-orbitrap mass spectrometer Thermo-Fischer Scientific
PAL system LHX – robotic system for handling HDX samples PAL system https://www.palsystem.com/index.php?id=840
Dionex Ultimate 3000, XRS pump Thermo Scientific
Dionex AXP-MS auxiliary pump Thermo Scientific
Software, Software Tools, Database search
Kfits: Fit aggregation Data http://kfits.reichmannlab.com/fitter/
Thermo Scientific Xcalibur software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30487
Q Exactive MS Series Tune Interface (Tune) https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/WS-MS-Q-Exactive-Calibration-Maintenance-iQuan2016-EN.pdf
Chronos software (Axel Semrau) http://www.axel-semrau.de/en/Software/Software+Solutions/Chronos-p-966.html
Proteome Discoverer V1.4 software https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/OPTON-30795
HDX workbench software http://hdx.florida.scripps.edu/hdx_workbench/Home.html
DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Fassler, R., Edinger, N., Rimon, O., Reichmann, D. Defining Hsp33’s Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (136), e57806, doi:10.3791/57806 (2018).
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