थाइमस-निर्भर और थाइमस-स्वतंत्र Immunoglobulin Isotype प्रतिक्रियाओं का प्रयोग चूहों में एंजाइम से जुड़े Immunosorbent परख का लक्षण वर्णन
Summary
इस पत्र में, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए टी निर्भर और टी-स्वतंत्र immunoglobulin (़) isotype की प्रतिक्रिया एलिसा का उपयोग चूहों में । इस विधि का इस्तेमाल किया अकेले या संयोजन में प्रवाह cytometry के साथ शोधकर्ताओं बी सेल में मतभेद की पहचान करने की अनुमति देगा-मध्यस्थता ़ isotype प्रतिक्रियाओं के बाद टी-निर्भर और टी स्वतंत्र प्रतिजन प्रतिरक्षण.
Abstract
एंटीबॉडी, भी इम्युनोग्लोबुलिन (़), विभेदित बी लिम्फोसाइटों, plasmablasts/प्लाज्मा कोशिकाओं द्वारा स्रावित के रूप में, विनोदी प्रतिरक्षा में एक विविध तंत्र के माध्यम से रोगजनकों पर आक्रमण के खिलाफ एक दुर्जेय रक्षा प्रदान । टीकाकरण का एक प्रमुख लक्ष्य सुरक्षात्मक प्रतिजन-विशिष्ट एंटीबॉडी जीवन के लिए खतरा संक्रमण को रोकने के लिए प्रेरित करने के लिए है । दोनों थाइमस-निर्भर (टीडी) और थाइमस-स्वतंत्र (TI) प्रतिजनों मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट आईजीएम प्रतिक्रियाओं को कर सकते हैं और भी isotype के उत्पादन को प्रेरित कर सकते हैं-बंद एंटीबॉडी (आईजीजी, IgA और IgE) साथ ही मदद के साथ स्मृति बी कोशिकाओं की पीढ़ी प्रतिजन प्रस्तुत कोशिकाओं (APCs) द्वारा प्रदान की । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए टीडी और तिवारी आइजी isotype प्रतिक्रियाओं में चूहों का उपयोग कर एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा). इस प्रोटोकॉल में, टीडी और तिवारी ़ प्रतिक्रियाएं चूहों में intraperitoneal (आईएफसआई) प्रतिरक्षण के साथ hapten-संयुग्मित मॉडल एंटीजन TNP-KLH (फिटकिरी में) और TNP-polysaccharide (पंजाब में) क्रमशः, द्वारा बटोरा जाता है । टीडी स्मृति प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए, फिटकिरी में TNP-KLH का एक बूस्टर प्रतिरक्षण एक ही प्रतिजन के साथ पहली प्रतिरक्षण के बाद 3 सप्ताह में दिया जाता है/सहायक. इससे पहले और प्रतिरक्षण के बाद विभिन्न समय बिंदुओं पर माउस सीरा काटा जाता है । कुल सीरम ़ स्तर और TNP-विशिष्ट एंटीबॉडी बाद में क्रमशः ़ isotype-विशिष्ट सैंडविच और अप्रत्यक्ष एलिसा का उपयोग कर quantified हैं । आदेश में सही ढंग से प्रत्येक ़ isotype के सीरम एकाग्रता को बढ़ाता है, नमूनों को उचित रूप से मानक curves के रैखिक श्रेणी के भीतर फिट पतला होने की जरूरत है । इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, हम लगातार उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता के साथ विश्वसनीय परिणाम प्राप्त किया है । जब ऐसे प्रवाह cytometry के रूप में अंय पूरक तरीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया, प्लीहा बी कोशिकाओं और immunohistochemical धुंधला (आइएचसी) के इन विट्रो संस्कृति में , इस प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं एंटीबॉडी की एक व्यापक समझ हासिल करने की अनुमति होगी एक दी प्रयोगात्मक सेटिंग में प्रतिक्रियाएं ।
Introduction
बी लिम्फोसाइटों विनोदी उन्मुक्ति में प्रमुख खिलाड़ी है और स्तनधारियों में केवल सेल प्रकार है कि एंटीबॉडी का उत्पादन करने में सक्षम हैं, भी इम्युनोग्लोबुलिन (़)1,2के रूप में पद । बी कोशिकाओं द्वारा स्रावित एंटीबॉडी बेअसर, opsonization सहित विविध तंत्र और सक्रियण के द्वारा रोगजनकों पर हमला करने के खिलाफ एक दुर्जेय रक्षा प्रदान करते हैं, सुरक्षात्मक प्रतिरक्षा के लिए अग्रणी3. बी कोशिकाओं द्वारा एंटीबॉडी का स्राव केवल विशिष्ट बी कोशिकाओं है, जो आम तौर पर दो अलग3संकेतों की आवश्यकता की पूर्ण सक्रियण के बाद प्राप्त होता है । संकेत 1 के लिए प्रतिजन (एजी) के प्रत्यक्ष बंधन द्वारा रिले है बी सेल रिसेप्टर (BCR) विशिष्ट भोली बी कोशिकाओं की सतह पर व्यक्त की3. संकेत 2 के स्रोत के आधार पर, बी सेल सक्रियण थाइमस-निर्भर (टीडी) या थाइमस-स्वतंत्र (TI)3,4में विभाजित किया जा सकता है । एक टीडी प्रतिजन प्रतिक्रिया में, संकेत 2 सक्रिय cognate CD4 टी सहायक (टीएच) कोशिकाओं, जो CD154 एक्सप्रेस, सह stimulatory रिसेप्टर CD40 बी कोशिकाओं1,2,3पर व्यक्त के लिए ligand द्वारा प्रदान की जाती है । एक TI antigen प्रतिक्रिया में, सिग्नल 2 से या तो टोल की सगाई की तरह रिसेप्टर्स (TLRs प्रकार के मामले में 1 ti एजी) या व्यापक पार से जोड़ने के BCRs (प्रकार के मामले में 2 ti एजी) बी कोशिकाओं पर3,4से आता है । टाइप 1 ती (ti-1) एंटीजन TLRs की माइक्रोबियल लाइगैंडों हैं, जिनमें बैक्टीरियल lipopolysaccharides (एलपीएस), वायरल RNAs, और माइक्रोबियल CpG डीएनए4,5शामिल हैं । प्रकार 2 ती (ti-2) एंटीजन अत्यधिक दोहराव संरचना है, और BCRs4,6के कई पार से जोड़ने से बी सेल करने के लिए लंबे समय तक और लगातार संकेत देने के लिए सक्षम हैं । TI-2 एंटीजन के विशिष्ट उदाहरणों में pneumococcal polysaccharides और hapten-संयुग्मित polysaccharide6,7शामिल हैं । दोनों टीडी और तिवारी एंटीजन मजबूत प्रतिजन-विशिष्ट आईजीएम प्रतिक्रियाओं को बटोर सकते हैं और isotype-स्विच्ड एंटीबॉडी (आईजीजी, IgA और IgE) के उत्पादन को प्रेरित कर सकते हैं प्रतिजन प्रस्तुत करने वाले कोशिकाओं (APCs) जैसे वृक्ष कोशिकाओं (dc)1 द्वारा प्रदान की गई मदद के साथ ,2,3. इसके अलावा, दोनों टीडी और तिवारी एंटीजन APCs की मदद से स्मृति प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने में सक्षम हैं, लेकिन टीडी एंटीजन स्मृति बी सेल जनरेशन3,8उत्प्रेरण में अधिक कुशल हैं.
इस प्रोटोकॉल में टीडी और तिवारी ़ प्रतिक्रियाएं चूहों में intraperitoneal (आईएफसआई) प्रतिरक्षण के साथ hapten-संयुग्मित मॉडल एंटीजन 2, 4, 6-trinitrophenyl-कीहोल limpet hemocyanin (TNP-KLH) और TNP-polysaccharide (तटस्थ, अत्यधिक बंटी और उच्च-मास) क्रमशः९,१०,११. टीडी एंटीजन आमतौर पर12एंटीबॉडी के उत्पादन को बढ़ाने के लिए एक सहायक के साथ प्रयोग किया जाता है । हमारे प्रोटोकॉल में यहां, TNP-KLH फिटकिरी के साथ इंजेक्शन है, प्रतिरक्षण अध्ययन में एक सामांय रूप से इस्तेमाल किया सहायक12। इस्तेमाल किया जा सकता है कि adjuvants के अन्य उदाहरणों में शामिल हैं पूर्ण या अपूर्ण Freund की सहायक (या आइएफए), monophosphoryl-लिपिड एक/trehalose dicorynomycolate (“रीबी” सहायक), और CpG oligodeoxynucleotides, आदि13, 14. प्रतिरक्षण के बाद, माउस सीरा अलग समय बिंदुओं पर काटा जाता है और सीरा में TNP-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग quantified हैं ़ isotype-विशिष्ट एंजाइम से जुड़े immunosorbent परख (एलिसा)9,10, 11.
एलिसा एक थाली है कि व्यापक रूप से चिकित्सा में एक नैदानिक उपकरण के रूप में और भी बायोमेडिकल रिसर्च15,16में एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में प्रयोग किया जाता है आधारित परख है । यह पता लगाने और एंटीबॉडी, हार्मोन, साइटोकिंस, chemokines, और विभिन्न प्रतिजनों, आदिसहित analytes मात्रा का उपयोग किया जाता है. एलिसा प्रत्यक्ष, अप्रत्यक्ष, सैंडविच और प्रतिस्पर्धी एलिसा15,16सहित कई विभिंन स्वरूपों में प्रदर्शन किया जा सकता है । सामांय में, यह एक ठोस सतह के लिए प्रतिजन के स्थिरीकरण शामिल है, आमतौर पर एक ९६ अच्छी तरह से microtiter प्लेट, जो एक प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन है । मशीन के बाद, असीम एंटीबॉडी दूर धोया जाता है । एक प्रत्यक्ष एलिसा में, प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे एक एंजाइम (आमतौर पर सहिजन peroxidase या alkaline फॉस्फेट) है, जो एक chromogenic सब्सट्रेट एक दृश्य रंग एक संकेत का पता लगाने के द्वारा पाया परिवर्तन उपज करने के लिए सट कर सकते है के लिए संयुग्मित है जैसे एक spectrophotometer१५,१६. इसके विपरीत, यदि एक एंजाइम से जुड़े माध्यमिक एंटीबॉडी प्राथमिक एंटीबॉडी बांध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, तो यह एक अप्रत्यक्ष एलिसा15,16के रूप में माना जाता है । प्रत्यक्ष एलिसा तेज है जबकि अप्रत्यक्ष एलिसा अधिक संवेदनशील15,16है । एक सैंडविच एलिसा में, प्लेटों एक “कब्जा” एंटीबॉडी नमूने में ब्याज की प्रतिजन स्थिर करने के लिए इस्तेमाल के साथ लेपित हैं, और फिर कब्जा कर लिया प्रतिजन एक प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष तरीके से15में एक और “पहचान” एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जा सकता है, 16. सैंडविच एलिसा उच्च विशिष्टता प्रदान करता है के बाद से प्रतिजन प्रतिजन के दो अलग एंटीबॉडी द्वारा पता चला है । प्रतिस्पर्धी एलिसा में, प्रतियोगिता नमूना प्रतिजन और प्लेट-बाउंड प्रतिजन के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के लिए बाध्यकारी के बीच स्थापित है, और फिर antigen एकाग्रता नमूना में सब्सट्रेट से संकेत में कमी को मापने के द्वारा quantified है 15 , 16. प्रतिस्पर्धी एलिसा उपर्युक्त प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष स्वरूप का उपयोग किया जा सकता है और केवल एक epitope15,16के साथ छोटे एंटीजन का पता लगाने के लिए उपयोगी है ।
एंटीबॉडी की माप के लिए वैकल्पिक तकनीक में रेडियो-immunoassay (रिया), electrochemiluminescence (ECL) की परख और भूतल plasmon अनुनाद (SPR) परख17शामिल हैं । रिया पहली immunoassay विकसित किया गया था कि एक प्रतिजन की उपस्थिति के उपाय (या एंटीबॉडी) उच्च विशिष्टता और radiolabeled रिएजेंट18,19का उपयोग कर संवेदनशीलता के साथ । हालांकि, रेडियोधर्मी विषाक्तता की चिंताओं के कारण, निपटान लागत, शेल्फ-जीवन और विशेष रूप से रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम लाइसेंस, एलिसा आम का उपयोग करता है के लिए एक बेहतर और अधिक सुविधाजनक तकनीक है20,21। ECL एक अति संवेदनशील परख जिसमें chemiluminescent प्रतिक्रियाओं बिजली का उपयोग करने के लिए एक इलेक्ट्रोड की सतह पर स्थिर पुरोगामी से उच्च प्रतिक्रियाशील प्रजातियों उत्पंन शुरू कर रहे हैं, और analytes की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (जैसे एंटीजन या एंटीबॉडी)22. हालांकि, ECL एक विशेष साधन की आवश्यकता है और इस तरह के रूप में व्यापक रूप से23एलिसा के रूप में इस्तेमाल नहीं है । SPR एक प्रत्यक्ष परख है कि लाइगैंडों के बंधन (जैसे, एंटीबॉडी) के लिए एक सेंसर चिप सतह24पर स्थिर अणुओं (जैसे, एंटीजन) को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । SPR वास्तविक समय में बातचीत का पता लगाता है बहुत विशेष रूप से और एलिसा में के रूप में लेबल रिएजेंट के उपयोग की आवश्यकता नहीं है । हालांकि, SPR भी एक विशेष उपकरण की आवश्यकता है और एलिसा17से कम संवेदनशीलता है । वैकल्पिक तरीकों की सीमाओं को देखते हुए, एलिसा इस प्रोटोकॉल में हमारे उद्देश्य के लिए सबसे उपयुक्त और सुविधाजनक तकनीक है । यहां, हम कुल ़ isotype स्तर के विश्लेषण के लिए सैंडविच एलिसा के उपयोग का वर्णन और प्रतिजन-विशिष्ट ़ isotypes के विश्लेषण के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा की प्रक्रियाओं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम एलिसा का उपयोग चूहों में टीडी और तिवारी ़ isotype प्रतिक्रियाओं के लक्षण वर्णन के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन. इस प्रोटोकॉल के सफल कार्यांवयन एलिसा परख प्लेटें, प्रतिरक्षण Ags, माउस ़ isotype-विशिष्ट एंटीबॉडी ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में स्वास्थ्य अनुदान R01 CA158402 (पी. Xie) और R21 AI128264 (पी. Xie) के राष्ट्रीय संस्थानों, रक्षा अनुदान W81XWH विभाग-13-1-0242 (पी. Xie), न्यू जर्सी के कैंसर संस्थान से अनुदान संख्या के माध्यम से एक पायलट पुरस्कार का समर्थन किया गया था P30CA072720 राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (Xie), एक बश बायोमेडिकल ग्रांट (Xie), एक विक्टर Stollar फैलोशिप (ए. लालानी), और एक ऐनी बी और जेंस बी Leathem फैलोशिप (एस. झू) से ।
Materials
| VersaMax Tunable Microplate Reader | MDS Analytical Technologies | VERSAMAX | Equipment to read the plates |
| SOFTmax PRO 5.3 | MDS Analytical Technologies | SOFTmax PRO 5.3 | Software for the plate reader |
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism | Software for graphing and statistics |
| TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) | Biosearch Technologies | F-1300-10 | A TI Ag for immunization |
| TNP-KLH | Biosearch Technologies | T-5060-5 | A TD Ag for immunization |
| TNP(38)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 38) | Coating Ag for TNP-specific ELISA |
| TNP(3)-BSA | Biosearch Technologies | T-5050-10 (conjugation ratio: 3) | Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig |
| Imject Alum | Fisher Scientific | PI-77161 | Alum adjuvant for immunization |
| Falcon Polypropylene tubes | Fisher Scientific | 14-959-11A | For incubation of TNP-KLH/alum |
| BD Insulin Syringe | Fisher Scientific | 14-829-1B | For i.p. injection of mice |
| Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom | Fisher Scientific | 14-245-61 | For ELISA |
| Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom | VWR | 82050-622 | For serial dilutions of standards and samples |
| Phosphatase substrate, 5 mg Tablets | Sigma | S0942-200TAB | AP substrate |
| Diethanolamine | VWR | IC15251690 | A component of AP substrate buffer |
| Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-01 | Capture Ab for mouse IgM |
| Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-01 | Capture Ab for mouse IgG1 |
| Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-01 | Capture Ab for mouse IgG2a |
| Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-01 | Capture Ab for mouse IgG2b |
| Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-01 | Capture Ab for mouse IgG3 |
| Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-01 | Capture Ab for mouse IgA |
| Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-01 | Capture Ab for mouse IgE |
| AP-Goat anti-mouse IgM | SouthernBiotech | 1020-04 | Detection Ab for mouse IgM |
| AP-Goat anti-mouse IgG1 | SouthernBiotech | 1070-04 | Detection Ab for mouse IgG1 |
| AP-Goat anti-mouse IgG2a | SouthernBiotech | 1080-04 | Detection Ab for mouse IgG2a |
| AP-Goat anti-mouse IgG2b | SouthernBiotech | 1090-04 | Detection Ab for mouse IgG2b |
| AP-Goat anti-mouse IgG3 | SouthernBiotech | 1100-04 | Detection Ab for mouse IgG3 |
| AP-Goat anti-mouse IgA | SouthernBiotech | 1040-04 | Detection Ab for mouse IgA |
| AP-Goat anti-mouse IgE | SouthernBiotech | 1110-04 | Detection Ab for mouse IgE |
| Mouse IgM standard | BD Biosciences | 553472 | TNP-specific IgM, Clone G155-228 |
| Mouse IgG1 standard | BD Biosciences | 554054 | TNP-specific IgG1, Clone 107.3 |
| Mouse IgG2a standard | BD Biosciences | 556651 | TNP-specific IgG2a, Clone G155-178 |
| Mouse IgG2b standard | BD Biosciences | 554055 | TNP-specific IgG2b, Clone 49.2 |
| Mouse IgG3 standard | BD Biosciences | 553486 | KLH-specific IgG3, Clone A112-3 |
| Mouse IgA standard | BD Biosciences | 550924 | Mineral oil-induced IgA, Clone MOPC-320 |
| Mouse IgE standard | BD Biosciences | 557079 | TNP-specific IgE, Clone C38-2 |
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