JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Karakteristikk av Thymus avhengig og uavhengig av Thymus immunglobulin Isotype svar i mus med enzym knyttet Immunosorbent analysen

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

I dette papir beskriver vi en protokoll for å karakterisere T-avhengige og T-uavhengig immunglobulin (Ig) isotype svar i mus med ELISA. Denne metoden brukes alene eller i kombinasjon med flyt cytometri vil tillate forskere å påpeke forskjeller i B-celle-mediert Ig isotype svar i mus etter T-avhengige og T-uavhengig antigen immunisering.

Abstract

Antistoffer, også kalt som immunglobuliner (Ig), skilles ut av differensiert B-lymfocytter, plasmablasts/plasma celler, i humoral immunitet gir en formidabel forsvar mot invaderende patogener via ulike mekanismer. Ett hovedmål vaksinasjon er å indusere beskyttende antigen-spesifikke antistoffer hindre livstruende infeksjoner. Både thymus-avhengige (TD) og thymus-uavhengig (TI) antigener kan framprovosere robust antigen-spesifikke IgM reaksjoner kan også indusere dannelsen av antistoffer som isotype-byttet (IgG, IgA og IgE) og generasjon minne B-celler med hjelp som antigen presentere celler (APCs). Her beskriver vi en protokoll for å karakterisere TD og TI Ig isotype svar i mus med enzym knyttet immunosorbent analysen (ELISA). I denne protokollen, er TD og TI Ig svar vakte i mus ved intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerte modell antigener TNP-KLH (i Alun) og TNP-polysakkarid (i PBS), henholdsvis. For å indusere TD minne svar, gis en booster immunisering av TNP-KLH i Alun ved 3 uker etter første immunisering med samme antigen/adjuvant. Musen sera høstes på ulike tidspunkt før og etter immunisering. Totalt serum Ig nivåer og TNP-spesifikke antistoffer er deretter kvantifisert med Ig isotype-spesifikke Sandwich og indirekte ELISA, henholdsvis. Riktig kvantifisere serum konsentrasjonen av hver Ig isotype, må prøver fortynnes hensiktsmessig for å passe innen lineær standard kurvene. Bruker denne protokollen, har vi konsekvent fått pålitelige resultater med høy spesifisitet og følsomhet. Når brukt i kombinasjon med andre komplementære metoder som flowcytometri, i vitro kultur splenic B celler og immunohistochemical tillater flekker (IHC), denne protokollen forskere å få et konstitusjonelt forståelse av antistoff svar i en gitt eksperimentelle.

Introduction

B-lymfocytter er den viktigste spilleren i humoral immunitet og eneste celle type i pattedyr som kan produsere antistoffer, også kalt immunglobuliner (Ig)1,2. Antistoffer utskilles av B-cellene inneholder en formidabel forsvar mot invaderende patogener via ulike mekanismer, inkludert nøytralisering, opsonization og komplementaktivering, fører til beskyttende immunitet3. Utskillelsen av antistoffer av B-celler oppnås bare etter full aktivering av bestemte B celler, som normalt krever to forskjellige signaler3. Signalet 1 videresendes ved direkte binding av antigen (Ag) til B-celle reseptor (BCR) uttrykt på overflaten av bestemte naiv B celler3. Avhengig av Signal 2, kan B celle aktivering deles inn i thymus-avhengige (TD) eller thymus-uavhengig (TI)3,4. En TD antigen svar leveres Signal 2 av aktivert beslektet CD4 T hjelper (TH) celler, som uttrykker CD154, ligand for co-stimulatory reseptoren CD40 uttrykt på B celler1,2,3. En TI antigen svar, Signal 2 kommer fra enten engasjement Toll-like reseptorer (TLRs ved 1 TI Ag) eller omfattende cross-linking av BCRs (ved 2 TI Ag) på B celler3,4. Type 1 TI (TI-1) antigener er mikrobiell ligander av TLRs, inkludert bakteriell lipopolysaccharides (LPS), viral RNAs og mikrobiell CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigener har svært repeterende struktur og kan levere langvarig og vedvarende signalisering til B-cellen ved flere cross-linking av BCRs4,6. Typiske eksempler på TI-2 antigener er pneumokokk polysakkarider og hapten-konjugerte polysakkarid6,7. Både TD og TI antigener kan framprovosere robust antigen-spesifikke IgM reaksjoner og kan også indusere dannelsen av antistoffer som isotype-byttet (IgG, IgA og IgE) ved hjelp av antigen presentere celler (APCs) som dendrittiske celler (DCs)1 ,2,3. Videre både TD og TI antigener kan indusere minne svar ved hjelp av APCs, men TD antigener er effektiv inducing minne B celle generasjon3,8.

I denne protokollen, er TD og TI Ig svar vakte i mus ved intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerte modell antigener 2,4,6-trinitrophenyl-nøkkelhullet albuskjell hemocyanin (TNP-KLH) og TNP-polysakkarid (nøytral, svært forgrenet og høy masse), henholdsvis9,10,11. TD antigener brukes vanligvis med en adjuvans for å forbedre produksjonen av antistoffer12. Her i vår protokollen injiseres TNP-KLH med alum, en brukte adjuvans i immunisering studier12. Andre eksempler på adjuvants som kan brukes er fullstendig eller ufullstendig Freund’s adjuvant (CFA eller IFA), monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adjuvant) og CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. etter immunisering, musen sera høstes på forskjellige tidspunkt og TNP-spesifikke antistoffer i sera er kvantifisert bruker Ig isotype-spesifikke enzymet knyttet immunosorbent analysen (ELISA)9,10, 11.

ELISA er en plate-baserte analysen som er mye brukt som et diagnostisk verktøy i medisin og også som en analytisk verktøy i biomedisinsk forskning15,16. Det brukes til å oppdage og kvantifisere analytter inkludert antistoffer, hormoner, cytokiner, chemokines, og ulike antigener, etc. ELISA kan utføres i flere ulike formater, inkludert direkte, indirekte, sandwich og konkurransedyktig ELISA15,16. Vanligvis innebærer immobilisering av antigen til en solid overflate, vanligvis en 96-brønnen microtiter plate, som er ruges med en primær antistoff. Etter inkubasjon er ubundet antistoffer vasket bort. I en direkte ELISA, primære antistoffer er direkte konjugert til et enzym (vanligvis pepperrotperoksidase eller alkalisk fosfatase), som kan holde seg et kromogent substrat for å gi en synlig fargeendring oppdaget av et signal-gjenkjenning instrument som en spektrofotometer15,16. I kontrast hvis et enzym knyttet sekundære antistoff binde primære antistoffer, regnes da dette som en indirekte ELISA15,16. Direkte ELISA er raskere mens indirekte ELISA er mer følsomme15,16. I en sandwich ELISA, platene er belagt med en “capture” antistoffer til nakkens antigen interesse prøvene, og deretter fanget antigen kan oppdages av en annen “oppdagelsen” antistoff i en direkte eller indirekte måte15, 16. Sandwich ELISA tilbyr høy spesifisitet siden antigen oppdages av to forskjellige antistoffer av antigen. En konkurransedyktig ELISA, konkurransen er etablert mellom eksempel antigen og plate-bundet antigen for binding til primære antistoffer og deretter antigen konsentrasjon i eksemplet er kvantifisert ved måling reduksjon i signalet fra underlaget 15 , 16. konkurransedyktige ELISA utføres med det ovennevnte formatet for direkte eller indirekte, og er nyttig for påvisning av små antigener med bare én epitope15,16.

Alternative teknikker for måling av antistoffer inkluderer radio-immunanalyse (RIA), electrochemiluminescence (ECL) analysen og overflate plasmon resonans (SPR) analysen17. RIA var den første immunanalyse utviklet som måler tilstedeværelsen av et antigen (eller antistoff) med stor detaljrikdom og følsomhet ved hjelp av radiolabeled reagenser18,19. Men på grunn av bekymringer for radioaktivt toksisitet, kasseringskostnader, holdbarhet og spesielle lisenser til å arbeide med radioaktivt materiale, ELISA er en bedre og enklere teknikk for vanlig bruker20,21. ECL er en høylig følsom analysen der chemiluminescent reaksjoner er initiert bruke elektrisitet til å generere svært reaktive arter fra stabil forløpere på overflaten av en elektrode, og kan brukes til å måle mengden av analytter (for eksempel antigener eller antistoffer)22. Men ECL krever en spesiell instrument og dermed så bredt brukes ikke som ELISA23. SPR er en direkte analyse som kan brukes til å måle binding av ligander (f.eks., antistoffer) til immobilisert molekyler (f.eks., antigener) på en sensor chip overflaten24. SPR oppdager interaksjoner i sanntid veldig spesielt og krever ikke bruk av merket reagenser som ELISA. Men SPR også krever en spesiell utstyr og har lavere følsomhet enn ELISA17. Gitt begrensninger av alternative metoder, er ELISA den mest egnet og praktisk teknikken for vår hensikt med denne protokollen. Her beskriver vi bruk av sandwich ELISA for analyse av totale Ig isotype nivåer og prosedyrene for indirekte ELISA for analyse av antigen-spesifikke Ig isotypes.

Protocol

Denne protokollen følger retningslinjene for institusjonelle Forsøksdyrutvalget etikk Rutgers University. Alle mus brukes NIH retningslinjer og under en dyr protokollen godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen. 1. forberedelse av mus og samling av naiv musen Sera Holde alle mus for immunisering eksperimenter i en bestemt patogen-fri dyr anlegget. Bruk kjønn-matchet, ung voksen (8-12 uker gamle) knockout og littermate kontroll mus som deler samme foreldre …

Representative Results

Vi har brukt denne protokollen for å undersøke rollene som en viktig regulator av immunsystemet, TRAF3, i TI og TD Ig isotype svar9,10,11. TRAF3 direkte eller indirekte regulerer signaltransduksjon en rekke medfødte og adaptive immunsystemet reseptorer, inkludert TNF reseptor gruppe, Toll-like reseptorer og T celle reseptor/CD28, blant annet27,<sup class="xre…

Discussion

Her beskriver vi protokollen for karakterisering av TD og TI Ig isotype svar i mus med ELISA. Vellykket implementering av denne protokollen krever bruk av materialer som er angitt i tabell 1, inkludert ELISA analysen plater, immunisering Ags, musen Ig isotype-spesifikke antistoffer og standarder. Forsiktighet bør utvises bruke vev kultur behandlet plater for ELISA. Fortynninger av standarder og serumprøver bør gjøres i separate ubehandlet plater (runde-nederst) og deretter lagt inn ELISA platene. Bru…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne studien ble støttet av National Institutes of Health tilskudd R01 CA158402 (P. Xie) og R21 AI128264 (P. Xie), det amerikanske forsvarsdepartementet gi W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), en Pilot Award fra Cancer Institute of New Jersey gjennom bevilgning nummer P30CA072720 fra National Cancer Institute (s. Xie), Busch biomedisinsk stipend (s. Xie), en Victor Stollar fellesskap (A. Lalani), og en Anne B. og James B. Leathem fellesskap (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors–sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O’Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O’Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
check_url/57843?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image