JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Характеристика тимус зависимых и тимус независимые иммуноглобулина изотипа ответов в мышей, используя энзим соединенный Assay иммуносорбента

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

В настоящем документе мы описываем протокол для характеристики Т-зависимых и T-независимой иммуноглобулина (Ig) изотипа ответы в мышах с помощью ИФА. Этот метод используется в одиночку или в сочетании с потоком цитометрии позволит исследователям для выявления различий в ответах изотипа Ig B клеточный мышей после иммунизации антигена Т-зависимых и T-независимой.

Abstract

Антитела, также называют как иммуноглобулины (Ig), выделяемый продифференцировано лимфоциты, клетки plasmablasts/плазмы, гуморальный иммунитет обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы. Одна из основных целей вакцинации является заставить защитный антиген специфические антитела для предотвращения опасных для жизни инфекций. Тимус зависимые (TD) и тимус независимые (TI) антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) а также генерации клеток памяти B с помощью предоставляемые антиген представляющих клеток (БТР). Здесь мы описываем протокол характеризовать TD и TI Ig изотипа ответы в мышей, используя энзим соединенный assay иммуносорбента (ELISA). В настоящем Протоколе TD и TI Ig ответы вызвал у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с антигенами конъюгированных Гаптены модель TNP-KLH (в квасцы) и ТНП полисахарида (в PBS), соответственно. Чтобы заставить TD памяти ответ, руля иммунизации TNP-KLH в квасцов дается на 3 недели после первой иммунизации с же антигена/адъювант. Sera мыши собирают в разное время точек до и после иммунизации. Всего в сыворотке Ig и ТНП специфические антитела являются впоследствии количественно с использованием сэндвич isotype специфических Ig и косвенные ELISA, соответственно. Чтобы правильно определить сывороточной концентрации каждого изотипа Ig, образцы необходимо надлежащим образом быть разбавлен по размеру в пределах диапазона линейной стандартных кривых. Используя этот протокол, мы последовательно получить надежные результаты с высокой специфичности и чувствительности. При использовании в комбинации с другими взаимодополняющими методами проточной цитометрии, в пробирке культуры splenic клетки B и иммуногистохимическое окрашивание (IHC), этот протокол позволит исследователям получить всеобъемлющее представление о антитела ответы в данной экспериментальной обстановке.

Introduction

Лимфоциты являются основным игроком в гуморального иммунитета и единственный тип клеток млекопитающих, которые способны производить антитела, также называются иммуноглобулины (Ig)1,2. Антитела секретным клетками B обеспечивают грозным защиту против вторжения патогены через различные механизмы, включая обезвреживание, опсонизацию и активации комплемента, ведущих к защитного иммунитета3. Секреция антител клетками B достигается только после полной активации конкретных клеток B, которая обычно требует двух различных сигналов3. B клеточного рецептора (BCR) выразил на поверхности клеток конкретных наивный B3путем прямого связывания антигена (Ag) передается сигнал 1. В зависимости от источника сигнала 2 клетки B активации можно разделить на тимус зависимые (ТД) или тимус независимые (TI)3,4. В ответ антигена TD 2 сигнала обеспечивается активированные родственных CD4 T вспомогательный (TH) клетки, которые Экспресс CD154, лигандом CD40 выразил на B клетки1,2,3co-stimulatory рецептор. В ответ TI антигена, сигнал 2 приходит от либо участия Толл подобные рецепторы (TLRs в случае типа 1 TI Ag) или обширные cross-linking БКРС (в случае 2 типа TI Ag) на B-клеток3,4. Тип 1 TI (TI-1) антигены являются микробной лигандами TLRs, включая бактериальных липополисахаридов (LPS), вирусной РНК и микробных CpG ДНК4,5. Антигены TI (TI-2) тип 2 имеют очень повторяющихся структуру и способны доставить длительное и стойких сигнализации B ячейку на несколько cross-linking БКРС4,6. Типичными примерами TI-2 антигенов пневмококковой полисахаридов и конъюгированных Гаптены полисахарид6,7. ТД и TI антигены можно добиться надежной реакции антиген специфически IgM и может также вызвать производство коммутацией isotype антитела (IgG, IgA и IgE) с помощью, предоставляемой антиген представляющих клеток (БТР), таких как дендритные клетки (DCs)1 ,2,3. Кроме того TD и TI антигены способны вызвать памяти ответы с помощью АСУ ТП, но TD антигены являются более эффективными в склонение памяти клетки B поколение3,8.

В этом протоколе TD и TI Ig ответы являются вызвало у мышей внутрибрюшинного (и.п.) иммунизации с конъюгированных Гаптены модель антигены 2,4,6-trinitrophenyl-замочной скважины магнитные Гемоцианин (ТНП-KLH) и ТНП полисахарида (нейтральный, сильно ветвистый и высокой масса), соответственно9,10,11. ТД антигены обычно используются с адъювантом для расширения производства антител12. Здесь в нашем протокол, ТНП-KLH вводят квасцов, часто используемых адъювант в иммунизации исследования12. Другие примеры адъювантов, которые могут быть использованы в полной или неполной адъювантной Фройнд ‘s (CFA или IFA), A монофосфатный липидов / Трегалоза dicorynomycolate («РМБИ» адъювантной) и CpG oligodeoxynucleotides,, и т.д.13 14. после иммунизации, сера мыши собирают в разное время точек и ТНП специфических антител в сыворотке количественно с помощью Ig изотипа специфичные иммуноферментного анализа (ИФА)9,10, 11.

ELISA является на основе плиты assay, который широко используется в качестве инструмента диагностики в медицине, а также аналитический инструмент в биомедицинских исследований,1516. Он используется для обнаружения и количественного определения аналитов включая антитела, гормоны, цитокины, chemokines и различные антигены и т.д. ELISA может выполняться в нескольких различных форматах, в том числе прямые, косвенные, сэндвич и конкурентоспособной ELISA15,16. В общем он включает иммобилизации антигена к твердой поверхности, обычно микротитровальных 96-луночных пластины, которые инкубировали с основного антитела. После инкубации несвязанные антитела смыты. В прямой ELISA, основное антитело непосредственно конъюгированных для фермента (обычно пероксидаза или щелочной фосфатазы), которые могут расщеплять Хромогенный субстрат приносить видимый цвет изменения, такие как определяется документом обнаружения сигнала Спектрофотометр15,16. Напротив если энзим соединенный вторичные антитела используется для связывания основное антитело, то это рассматривается как косвенные ELISA15,16. Прямые ELISA является быстрее, тогда как косвенные ELISA является более чувствительным15,16. В сэндвич ELISA пластины покрыты «захват» антитела используются для иммобилизации антигена интереса в образцах, а затем захватили антиген может быть обнаружен еще один «обнаружения» антител в прямой или косвенной форме15, 16. сэндвич ELISA предлагает высокую специфичность, так как обнаружено два различных антител антигена антиген. В конкурентных ELISA конкурс устанавливается между образца антигена и плита прыгните антигена для привязки к основное антитело, а затем концентрации антигена в образце количественно измеряя снижение сигнала от субстрата 15 , 16. конкурентные ELISA может производиться с использованием упомянутых выше прямого или косвенного формат и полезен для обнаружения небольших антигены с только один epitope15,16.

Альтернативные методы для измерения антитела включают в себя радио-иммуноферментного анализа (RIA), electrochemiluminescence (ЭСЛ) пробирного и поверхности плазмон резонанса (СРП) пробирного17. РИА был первый иммуноанализа разработали что меры присутствие антигена (или антитела) с высокой специфичности и чувствительности с использованием radiolabeled реагенты18,19. Однако из-за проблем радиоактивных токсичности, затраты на утилизацию, срок годности и специальных лицензий для работы с радиоактивными материалами, ELISA лучше и более удобный метод для распространенных использует20,21. ECL является весьма деликатным методом в котором инициируются с помощью электричества для создания высокой реакционной способностью видов из стабильных прекурсоров на поверхности электрода хемилюминесцентный реакции и может использоваться для измерения количества аналитов (таких как антигены или антитела)22. Однако ЭСЛ требует специального инструмента и таким образом не используется так широко как Элиза23. СРП является прямым assay, который может использоваться для измерения Связывание лиганда (например., антитела) для иммобилизованных молекул (например., антигены) на сенсоре чип поверхности24. СРП очень конкретно определяет взаимодействия в режиме реального времени и не требует использования маркированных реагентов как ELISA. Однако SPR также требует специального оборудования и имеет более низкую чувствительность чем ELISA17. Ввиду ограничений, обусловленных альтернативных методов, ELISA является наиболее подходящим и удобным для нашей цели в настоящем Протоколе. Здесь мы описывают использование сэндвич ELISA для анализа общего уровня изотипа Ig и процедурах косвенного ELISA для анализа антиген специфические Ig изотипов.

Protocol

Этот протокол соответствует руководящим принципам Комитета по этике институциональных исследований на животных по Rutgers University. Все мыши используются в соответствии с низ руководящие принципы и животных протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использования Коми?…

Representative Results

Мы использовали этот протокол для расследования роли критической регулятор иммунной системы, TRAF3, TI и TD иг изотипа ответы9,10,11. TRAF3 прямо или косвенно регулирует трансдукции сигнала целого ряда врожденная и адаптивного…

Discussion

Здесь мы описываем протокол для характеризации TD и TI Ig изотипа ответов в мышах с помощью ИФА. Успешное осуществление этого протокола требует использования материалов, указанных в таблице 1, включая ELISA пробирного пластины, иммунизации Ags, мыши изотипа Ig-антитела и стандартов. Сл…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано национальными институтами здравоохранения грантов R01 CA158402 (P. Xie) и R21 AI128264 (P. Xie), Министерство обороны Грант W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), пилот награду от рака института Нью-Джерси через Грант номер P30CA072720 от национального института рака (P. Xie), Буш биомедицинских Грант (P. Xie), Виктор Stollar стипендий (A. Лалани) и Анна б. и Джеймс б. Leathem стипендий (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors–sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O’Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O’Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
check_url/57843?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image