JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Karakterisering av Thymus-beroende och oberoende av Thymus immunglobulin isotypen Svaren hos möss använder Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

I detta papper beskriver vi ett protokoll för att karakterisera T-beroende och T-oberoende immunglobulin (Ig) isotypen svaren i möss med hjälp av ELISA. Denna metod används ensamt eller i kombination med flöde flödescytometri tillåter forskare att identifiera skillnader i B cell-medierad Ig isotypen Svaren hos möss efter T-beroende och T-oberoende antigen immunisering.

Abstract

Antikroppar, också betecknas som immunoglobuliner (Ig), utsöndras av differentierade B-lymfocyter, plasmablasts/plasma celler, i humorala immuniteten ger en formidabel försvar mot invaderande patogener via olika mekanismer. Ett huvudsyfte med vaccination är att inducera skyddande antigen-specifika antikroppar att förhindra livshotande infektioner. Både bräss-beroende (TD) och thymus-oberoende (TI) antigener kan framkalla robust antigen-specifika IgM svaren och kan även inducera produktion av isotyp-bytte antikroppar (IgG, IgA och IgE) samt generering av minnesceller B med hjälp som tillhandahålls av antigenpresenterande celler (APC). Här beskriver vi ett protokoll för att karakterisera TD och TI Ig isotypen svaren i möss med glykoproteinenzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA). I detta protokoll, är TD och TI Ig Svaren framkallas hos möss av intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerad modell antigener TNP-KLH (i Alun) och TNP-polysackarider (i PBS), respektive. För att inducera TD minne svar, ges en booster immunisering av TNP-KLH i alum på 3 veckor efter den första immunisering med samma antigen/adjuvans. Mus sera skördas vid olika tidpunkter före och efter immunisering. Totalt Ig serumnivåer och TNP-specifika antikroppar kvantifieras därefter med Ig isotyp-specifika smörgås och indirekt ELISA, respektive. För att korrekt kvantifiera serumkoncentrationen av varje Ig isotypen, behöver proverna spädas på lämpligt sätt för att passa i det linjära området av standard kurvor. Använder detta protokoll, har vi konsekvent få pålitliga resultat med hög specificitet och känslighet. När används i kombination med andra kompletterande metoder såsom flödescytometri, in vitro- kultur av mjälten B-celler och immunhistokemisk tillåter färgning (IHC), detta protokoll forskare att få en omfattande förståelse av antikropp svaren i en viss experimentella inställning.

Introduction

B-lymfocyter är den viktigaste spelaren i humoral immunitet och den enda Celltypen i däggdjur som klarar producera antikroppar, också betecknas som immunoglobuliner (Ig)1,2. Antikroppar utsöndras av B-celler ger en formidabel försvar mot invaderande patogener via olika mekanismer, inklusive neutralisering, opsonization och komplementaktivering, leder till skyddande immunitet3. Utsöndringen av antikroppar av B-celler uppnås endast efter fullständig aktivering av specifika B-celler, vilket normalt kräver två separata signaler3. Signal 1 vidarebefordras genom direkta bindning av antigenet (Ag) till B-cells receptor (BCR) uttrycks på ytan av specifika naiva B celler3. Beroende på källan Signal 2, kan B-cellaktivering delas in i thymus-beroende (TD) eller thymus-oberoende (TI)3,4. En TD antigen svar lämnas Signal 2 aktiverade cognate CD4 T helper (TH) celler, som uttrycker CD154, liganden för co-stimulatory receptorn CD40 uttryckt på B celler1,2,3. En TI antigen svar, Signal 2 kommer från antingen engagemang av Toll-liknande receptorer (TLR vid typ 1 TI Ag) eller omfattande cross-linking av de bindande företagsbestämmelser (vid typ 2 TI Ag) på B-celler3,4. Typ 1 TI (TI-1) antigener är mikrobiell ligander av TLRs, inklusive bakteriella lipopolysackarider (LPS), viral RNAs, och mikrobiell CpG DNA4,5. Typ 2 TI (TI-2) antigener har mycket repetitiva struktur, och kan leverera långvarig och ihållande signalering till B-cellen av flera cross-linking av bindande företagsbestämmelser4,6. Typiska exempel av TI-2 antigen är pneumokocker polysackarider och hapten-konjugerade polysackaridvaccin6,7. Både TD och TI antigener kan framkalla robust antigen-specifika IgM svaren och kan även inducera produktion av isotyp-bytte antikroppar (IgG, IgA och IgE) med hjälp som tillhandahålls av antigenpresenterande celler (APC) såsom dendritiska celler (DCs)1 ,2,3. Dessutom både TD och TI antigener kan inducera minne svaren med hjälp av trupptransportfordon, men TD antigener är effektivare framkalla minne B cell generation3,8.

I detta protokoll, är TD och TI Ig Svaren framkallas hos möss av intraperitoneal (IP) immunisering med hapten-konjugerad modell antigener 2,4,6-trinitrophenyl-keyhole limpet hemocyanin (TNP-KLH) och TNP-polysackarid (neutral, mycket Grenade och stor massa) respektive9,10,11. TD antigener används vanligen med ett adjuvans för att öka produktionen av antikroppar12. Här i våra protokoll injiceras TNP-KLH med Alun, ett vanligt förekommande adjuvant i immunisering studier12. Andra exempel på tillsatser som kan användas är fullständig eller ofullständig Freund’s adjuvans (CFA eller IFA), monophosphoryl-lipid A / trehalos dicorynomycolate (”Ribi” adjuvans) och CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. efter immunisering, mus sera skördas vid olika tidpunkter och TNP-specifika antikroppar i sera kvantifieras med Ig isotyp-specifika enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA är en tallrik-baserad analys som ofta används som ett diagnostiskt verktyg i medicin och även som ett analytiskt verktyg i biomedicinsk forskning15,16. Det används för att påvisa och kvantifiera analyter inklusive antikroppar, hormoner, cytokiner, chemokiner, och olika antigener, etc. ELISA kan utföras i flera olika format, inklusive direkta, indirekta, smörgås och konkurrenskraftiga ELISA15,16. I allmänhet innebär det immobilisering av antigenet på en fast yta, vanligtvis en 96 brunnar mikrotiterplattan, som ruvas av en primär antikropp. Efter inkubation tvättas den obunden antikroppen bort. I en direkt ELISA, primära antikroppen är direkt konjugerat med ett enzym (vanligtvis pepparrotsperoxidas eller alkaliskt fosfatas), som kan klyva ett kromogent substrat för att ge en synlig färgförändring upptäcks av ett signaldetektion instrument såsom en spektrofotometer15,16. Däremot om en enzymkopplad sekundär antikropp används för att binda den primär antikroppen, anses då detta som en indirekt ELISA15,16. Direkt ELISA är snabbare medan indirekt ELISA är känsligare15,16. I en sandwich-ELISA, plattorna är belagda med en ”fånga” antikropp används för att immobilisera antigenet sevärdheter i proven och sedan fångade antigenet kan upptäckas av en annan ”upptäckt” antikropp i en direkt eller indirekt sätt15, 16. Sandwich ELISA erbjuder hög specificitet eftersom antigenet påvisas genom två olika antikroppar av antigenet. I ett kompetitivt ELISA, tävlingen upprättas mellan prov antigenet och plattan-bundna antigenet för bindning till primära antikroppen och då koncentrationen av antigen i provet kvantifieras genom att mäta minskningen av signalen från underlaget 15 , 16. kompetitiva ELISA-test kan utföras i ovan nämnda direkta eller indirekta format och är användbart för att upptäcka små antigener med endast en epitop15,16.

Alternativa tekniker för mätning av antikroppar inkluderar radioimmunoassay (RIA), elektrokemiluminescens (ECL) test och ytan plasmon resonans (SPR) assay17. RIA var den första immunoassay utvecklade som mäter förekomsten av ett antigen (eller antikropp) med hög specificitet och känslighet med radiomärkt reagenser18,19. Men på grund av oro som radioaktiva toxicitet, kostnader för bortskaffande, hållbarhet och speciella licenser att arbeta med radioaktivt material, ELISA är en bättre och bekvämare teknik för common använder20,21. ECL är en mycket känslig analys där Kemiluminiscens reaktioner initieras använder el för att generera mycket reaktiva arter från stabil prekursorer på ytan av en elektrod och kan användas för att mäta mängden analyter (såsom antigener eller antikroppar)22. Dock ECL kräver ett speciellt instrument och därmed så brett används inte som ELISA23. SPR är en direkt som kan användas för att mäta bindningen av ligander (t.ex., antikroppar) till orörlig molekyler (t.ex., antigener) på en sensor chip ytan24. SPR upptäcker interaktioner i realtid mycket specifikt och kräver inte användning av märkta reagenser som i ELISA. SPR också kräver emellertid en särskild utrustning och har lägre känslighet än ELISA17. ELISA med tanke på begränsningarna av alternativa metoder, och är den mest lämpliga och bekväma tekniken för vårt syfte i detta protokoll. Här, beskriver vi användningen av sandwich-ELISA för analys av totalt Ig isotypen nivåer och förfarandena i indirekt ELISA för analys av antigen-specifika Ig isotyper.

Protocol

Detta protokoll följer riktlinjerna i institutionella djurförsök etikkommitté Rutgers University. Alla möss används enligt NIH riktlinjer och i ett djurs protokoll som godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén. 1. beredning av möss och samling av naiva mus serum Hålla alla möss för immunisering experiment i ett specifikt patogenfria djuranläggningen. Användning kön-matchade, ung vuxen (8 – 12 veckor gamla) knockout och littermate …

Representative Results

Vi har använt detta protokoll för att undersöka roller en kritisk regulator av immunförsvaret, TRAF3, TI och TD Ig isotypen Svaren9,10,11. TRAF3 direkt eller indirekt reglerar den signalera transductionen av ett antal medfödd och adaptiv immun receptorer, inklusive TNF receptor överfamiljen, Toll-liknande receptorer och T cell receptor/CD28, bland annat27,…

Discussion

Här beskriver vi protokollet för karakterisering av TD och TI Ig isotypen svaren i möss med hjälp av ELISA. Framgångsrikt genomförande av detta protokoll kräver användning av material som anges i tabell 1, inklusive immunisering Ags, mus Ig isotyp-specifika antikroppar, ELISA assay tallrikar och standarder. Vård bör vidtas för att undvika att använda vävnadsodling behandlade plattor för ELISA. Utspädningar av standarder och serumprov bör göras i separata obehandlad plattor (runda-ner) oc…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denna studie stöddes av National Institutes of Health bidrag R01 CA158402 (P. Xie) och R21 AI128264 (P. Xie), Department of Defense bevilja W81XWH-13-1-0242 (s. Xie), en Pilot Award från den Cancer Institute New Jersey genom Grant nummer P30CA072720 från National Cancer Institute (s. Xie), Busch biomedicinsk bidrag (s. Xie), en Stollar Victor-stipendiet (A. Lalani), och en Anne B. och James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors–sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O’Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O’Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
check_url/57843?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image