JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Immunology and Infection

Karakterisering af Thymus-afhængige og Thymus-uafhængig Immunoglobulin Isotype svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet Immunosorbent Assay

Published: September 07, 2018
doi:
10.3791/57843
, ,
1Department of Cell Biology and Neuroscience and Graduate Program in Cellular and Molecular Pharmacology,Rutgers University, 2Department of Cell Biology and Neuroscience,Rutgers University, 3Rutgers Cancer Institute of New Jersey

Summary

I dette papir beskriver vi en protokol for at karakterisere T-afhængige og T-uafhængig immunglobulin (Ig) isotype svar i mus ved hjælp af ELISA. Denne metode anvendes alene eller i kombination med flow flowcytometri giver forskere til at identificere forskelle i B-celle-medieret Ig isotypen svar i mus efter T-afhængige og T-uafhængig antigen immunisering.

Abstract

Antistoffer, også betegnes som immunoglobuliner (Ig), udskilles af differentierede B-lymfocytter, plasmablasts/plasma celler, i LUN Immunitet giver et formidabelt forsvar mod invaderende patogener via forskellige mekanismer. Et større mål af vaccination er at fremkalde beskyttende antigen-specifikke antistoffer til at forhindre livstruende infektioner. Både thymus-afhængige (TD) og thymus-uafhængig (TI) antigener kan fremkalde robust antigen-specifikke IgM svar og kan også fremkalde produktion af isotype-switched antistoffer (IgG, IgA og IgE) såvel som generation af hukommelse B-celler med hjælp leveret af antigen præsentere celler (PMV’er). Her, beskriver vi en protokol for at karakterisere TD og TI Ig isotypen svar i mus ved hjælp af enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA). I denne protokol, er TD og TI Ig svar fremkaldes i mus ved intraperitoneal (i.p.) immunisering med hapten-konjugeret model antigener TNP-KLH (i alun) og TNP-polysaccharid (i PBS), henholdsvis. For at fremkalde TD hukommelse svar, gives en booster immunisering af TNP-KLH i alun 3 uger efter den første vaccination med den samme antigen/adjuvans. Musen sera er høstet på forskellige tidspunkter før og efter immunisering. Total serum Ig niveauer og TNP-specifikke antistoffer er efterfølgende kvantificeres ved hjælp af Ig isotypen-specifikke Sandwich og indirekte ELISA, henholdsvis. For korrekt kvantificere serumkoncentrationen af hver Ig isotypen, skal prøverne fortyndes tilstrækkeligt til at passe inden for det lineære område af standard kurver. Ved hjælp af denne protokol, har vi konsekvent opnået pålidelige resultater med høj specificitet og sensitivitet. Når de anvendes i kombination med andre komplementære metoder såsom flowcytometri, i vitro kultur af milt B-celler og immunhistokemisk vil farvning (IHC), denne protokol give forskere en omfattende forståelse af antistof svar i en given eksperimentelle indstilling.

Introduction

B-lymfocytter er den vigtigste aktør i LUN Immunitet og den eneste celletype i pattedyr, der er i stand til at producere antistoffer, også betegnes som immunoglobuliner (Ig)1,2. Antistoffer udskilles af B-celler giver et formidabelt forsvar mod invaderende patogener via forskellige mekanismer, herunder neutralisering, hjælp og komplement aktivering, fører til beskyttende immunitet3. Sekretion af antistoffer af B-celler er kun opnås efter fuld aktivering af specifikke B-celler, der normalt kræver to særskilte signaler3. Signal 1 relæsendes af direkte binding af antigen (Ag) til B-celle receptoren (BCR) udtrykkes på overfladen af specifikke naive B celler3. Afhængigt af kilden til Signal 2, kan B-celle aktivering opdeles i thymus-afhængige (TD) eller thymus-uafhængig (TI)3,4. En TD antigen svar tilbydes Signal 2 af aktiverede beslægtet CD4 T hjælper (TH) celler, der udtrykker CD154, ligand for den co-stimulatory receptor CD40 udtrykt på B celler1,2,3. En TI antigen svar, Signal 2 kommer fra enten engagement af Toll-lignende receptorer (TLRs for type 1 TI Ag) eller omfattende cross-linking af oplysningspligt (i tilfælde af type 2 TI Ag) på B-celler3,4. Type 1 TI (TI-1) antigener er mikrobielle ligander af TLRs, herunder bakteriel lipopolysaccharides (LPS), viral RNA’er, og mikrobielle CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigener har hyppigt gentagne struktur, og er i stand til at levere langvarig og vedvarende signalerer til B-celle af flere cross-linking af referencematerialer4,6. Typiske eksempler på TI-2 antigener omfatter pneumokok polysaccharider og hapten-konjugeret polysaccharid6,7. Både TD og TI antigener kan fremkalde robust antigen-specifikke IgM svar og kan også fremkalde produktion af isotype-switched antistoffer (IgG, IgA og IgE) ved hjælp af antigen præsentere celler (PMV’er) såsom dendritiske celler (DCs)1 ,2,3. Desuden både TD og TI antigener er stand til at inducere hukommelse svar ved hjælp af pansrede mandskabsvogne, men TD antigener er mere effektive på overtalelse hukommelse B-celle generation3,8.

I denne protokol, er TD og TI Ig svar fremkaldes i mus ved intraperitoneal (i.p.) immunisering med hapten-konjugeret model antigener 2,4,6-trinitrophenyl-Nøglehullet limpet hemocyanin (TNP-KLH) og TNP-polysaccharid (neutral, stærkt forgrenet og high-mass), henholdsvis9,10,11. TD antigener bruges normalt med en adjuvant til at øge produktionen af antistoffer12. Her i vores protokol sprøjtes TNP-KLH med alun, et almindeligt anvendte adjuvans i immunisering undersøgelser12. Andre eksempler på adjuvanser, der kan bruges fuldstændig eller ufuldstændig Freund’s adjuvans (CFA eller IFA), monophosphoryl-lipid A / trehalose dicorynomycolate (“Ribi” adjuvans) og CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. efter immunisering, mus sera er høstet på forskellige tidspunkter og TNP-specifikke antistoffer i sera er kvantificeret ved hjælp af Ig isotypen-specifikke enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.

ELISA er en plade-baseret analyse, der er almindeligt anvendt som en diagnostisk redskab i medicin og også som et analytisk redskab i biomedicinsk forskning15,16. Det bruges til at detektere og kvantificere analysander herunder antistoffer, hormoner, cytokiner, kemokiner, og forskellige antigener, osv. ELISA kan udføres i flere forskellige formater, herunder direkte, indirekte, sandwich og konkurrencedygtige ELISA15,16. I almindelighed, indebærer det immobilisering af antigen til en fast overflade, normalt en 96-brønd mikrotiter plade, der er inkuberes med en primær antistof. Efter inkubationen er den ubundne antistof skyllet væk. I en direkte ELISA, er det primære antistof direkte konjugeret med et enzym (typisk peberrodsperoxidase eller alkalisk fosfatase), der kan Kløve et kromogent substrat for at give en synlig farveændring opdaget af en signal-påvisning instrument som en Spektrofotometer15,16. Derimod hvis en enzym-forbundet sekundær antistof bruges til at binde det primære antistof, betragtes så dette som en indirekte ELISA15,16. Direkte ELISA er hurtigere indirekte ELISA er mere følsomme15,16. I en sandwich ELISA, pladerne er belagt med en “fange” antistof bruges til at immobilisere antigener af interesse i prøverne, og derefter de erobrede antigen kan påvises ved en anden “opdagelse” antistof i en direkte eller indirekte måde15, 16. Sandwich ELISA tilbyder høj specificitet da antigen påvises ved to forskellige antistoffer af antigenet. I en konkurrerende ELISA, konkurrencen er etableret mellem de prøve og plade-bundet antigen for binding til det primære antistof og derefter antigen koncentration i prøven er kvantificeret ved at måle reduktionen af signal fra underlaget 15 , 16. konkurrerende ELISA kan udføres ved hjælp af den ovenfor nævnte direkte eller indirekte format og er nyttigt til påvisning af små antigener med kun én epitop15,16.

Alternative teknikker til måling af antistoffer omfatter radio-immunassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) analyse og overflade plasmon resonans (SPR) assay17. RIA var den første immunassay udviklet at foranstaltninger tilstedeværelsen af et antigen (eller antistof) med høj specificitet og sensitivitet ved hjælp af radiolabeled reagenser18,19. Men på grund af bekymringer af radioaktive giftighed, bortskaffelsesomkostninger, holdbarhed og særlige licenser til at arbejde med radioaktive materialer, ELISA er en bedre og mere bekvem teknik for fælles bruger20,21. ECL er et meget følsomt assay hvor kemiluminescens reaktioner er indledt ved hjælp af elektricitet for at generere meget reaktive arter fra stabil prækursorer på overfladen af en elektrode, og kan bruges til at måle mængden af analysander (såsom antigener eller antistoffer)22. Men ECL kræver et særligt instrument og dermed så bredt anvendes ikke som ELISA23. SPR er en direkte analyse, der kan bruges til at måle bindingen af ligander (fx., antistoffer) til immobiliseret molekyler (fx., antigener) på en sensor chip overflade24. SPR registrerer interaktioner i realtid meget specifikt og kræver ikke brug af mærkede reagenser som i ELISA. Men SPR også kræver et særligt udstyr og har lavere følsomhed end ELISA17. I betragtning af begrænsningerne af de alternative metoder, er ELISA den mest passende og praktisk teknik til vores formål i denne protokol. Her, beskriver vi brugen af sandwich ELISA til analyse af samlede Ig isotypen niveauer og procedurer af indirekte ELISA til analyse af antigen-specifikke Ig isotypes.

Protocol

Denne protokol følger retningslinjerne i institutionelle animalske videnskabsetisk komité af Rutgers University. Alle mus der anvendes i henhold til NIH retningslinjer og under en animalsk protokol godkendes af det institutionelle Animal Care og brug udvalg. 1. forberedelse af mus og samling af naive mus Sera Holde alle mus for immunisering eksperimenter i et specifikt patogenfrie dyr facilitet. Brug køn-matchede, unge voksen (8-12 uger gamle) knockout og littermate styr…

Representative Results

Vi har brugt denne protokol til at undersøge rollerne af en kritisk regulator af immunsystemet, TRAF3, i TI og TD Ig isotypen svar9,10,11. TRAF3 direkte eller indirekte regulerer signaltransduktion af en række medfødte og adaptive immun receptorer, herunder TNF receptor superfamily, Toll-lignende receptorer og T celle receptoren/CD28, blandt andre27,<sup clas…

Discussion

Her beskriver vi protokollen til karakterisering af TD og TI Ig isotypen svar i mus ved hjælp af ELISA. Vellykket gennemførelse af denne protokol kræver anvendelse af materialer, der er angivet i tabel 1, herunder ELISA assay plader, immunisering Ags, mus Ig isotypen-specifikke antistoffer og standarder. Pleje bør tages til at undgå at bruge vævskultur behandlet plader til ELISA. Fortyndinger af standarder og serumprøver skal gjort i separate ubehandlet plader (runde-bund) og derefter tilføjes i …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Denne undersøgelse blev støttet af de nationale kontorer i sundhed tilskud R01 CA158402 (P. Xie) og R21 AI128264 (P. Xie), Department of Defense give W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), en Pilot Award fra Cancer Institute of New Jersey gennem tilskud antal P30CA072720 fra National Cancer Institute (P. Xie), en Busch biomedicinsk Grant (P. Xie), en Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), og en Anne B. og James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Materials

VersaMax Tunable Microplate Reader MDS Analytical Technologies VERSAMAX Equipment to read the plates
SOFTmax PRO 5.3 MDS Analytical Technologies SOFTmax PRO 5.3 Software for the plate reader
GraphPad Prism GraphPad Prism Software for graphing and statistics
TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL) Biosearch Technologies F-1300-10 A TI Ag for immunization
TNP-KLH Biosearch Technologies T-5060-5 A TD Ag for immunization
TNP(38)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 38) Coating Ag for TNP-specific ELISA
TNP(3)-BSA Biosearch Technologies T-5050-10 (conjugation ratio: 3) Coating Ag for high affinity TNP-specific Ig
Imject Alum Fisher Scientific  PI-77161 Alum adjuvant for immunization
Falcon Polypropylene tubes Fisher Scientific  14-959-11A For incubation of TNP-KLH/alum
BD Insulin Syringe Fisher Scientific  14-829-1B For i.p. injection of mice
Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom Fisher Scientific  14-245-61 For ELISA
Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom VWR 82050-622 For serial dilutions of standards and samples
Phosphatase substrate, 5 mg Tablets Sigma S0942-200TAB AP substrate
Diethanolamine VWR IC15251690 A component of AP substrate buffer
Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-01 Capture Ab for mouse IgM
Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-01 Capture Ab for mouse IgG1
Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-01 Capture Ab for mouse IgG2a
Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-01 Capture Ab for mouse IgG2b
Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-01 Capture Ab for mouse IgG3
Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-01 Capture Ab for mouse IgA
Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-01 Capture Ab for mouse IgE
AP-Goat anti-mouse IgM SouthernBiotech 1020-04 Detection Ab for mouse IgM
AP-Goat anti-mouse IgG1 SouthernBiotech 1070-04 Detection Ab for mouse IgG1
AP-Goat anti-mouse IgG2a SouthernBiotech 1080-04 Detection Ab for mouse IgG2a
AP-Goat anti-mouse IgG2b SouthernBiotech 1090-04 Detection Ab for mouse IgG2b
AP-Goat anti-mouse IgG3 SouthernBiotech 1100-04 Detection Ab for mouse IgG3
AP-Goat anti-mouse IgA SouthernBiotech 1040-04 Detection Ab for mouse IgA
AP-Goat anti-mouse IgE SouthernBiotech 1110-04 Detection Ab for mouse IgE
Mouse IgM standard BD Biosciences 553472 TNP-specific IgM, Clone  G155-228
Mouse IgG1 standard BD Biosciences 554054 TNP-specific IgG1, Clone  107.3
Mouse IgG2a standard BD Biosciences 556651 TNP-specific IgG2a, Clone  G155-178
Mouse IgG2b standard BD Biosciences 554055 TNP-specific IgG2b, Clone  49.2
Mouse IgG3 standard BD Biosciences 553486 KLH-specific IgG3, Clone  A112-3
Mouse IgA standard BD Biosciences 550924 Mineral oil-induced IgA, Clone  MOPC-320
Mouse IgE standard BD Biosciences 557079 TNP-specific IgE, Clone  C38-2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moise, A., Nedelcu, F. D., Toader, M. A., Sora, S. M., Tica, A., Ferastraoaru, D. E., Constantinescu, I. Primary immunodeficiencies of the B lymphocyte. Journal of Medicine and Life. 3, 60-63 (2010).
  2. Bishop, G. A., Haxhinasto, S. A., Stunz, L. L., Hostager, B. S. Antigen-specific B-lymphocyte activation. Critical Reviews in Immunology. 23, 149-197 (2003).
  3. Murphy, K. . Janeway’s Immunobiology. 8th Edition. 1, (2012).
  4. Vinuesa, C. G., Chang, P. P. Innate B cell helpers reveal novel types of antibody responses. Nature Immunology. 14, 119-126 (2013).
  5. Bekeredjian-Ding, I., Jego, G. Toll-like receptors–sentries in the B-cell response. Immunology. 128, 311-323 (2009).
  6. Mond, J. J., Lees, A., Snapper, C. M. T cell-independent antigens type 2. Annual Review of Immunology. 13, 655-692 (1995).
  7. Garcia de Vinuesa, C., O’Leary, P., Sze, D. M., Toellner, K. M., MacLennan, I. C. T-independent type 2 antigens induce B cell proliferation in multiple splenic sites, but exponential growth is confined to extrafollicular foci. European Journal of Immunology. 29, 1314-1323 (1999).
  8. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nature Reviews Immunology. 15, 149-159 (2015).
  9. Xie, P., Stunz, L. L., Larison, K. D., Yang, B., Bishop, G. A. Tumor necrosis factor receptor-associated factor 3 is a critical regulator of B cell homeostasis in secondary lymphoid organs. Immunity. 27, 253-267 (2007).
  10. Xie, P., Kraus, Z. J., Stunz, L. L., Liu, Y., Bishop, G. A. TNF Receptor-Associated Factor 3 Is Required for T Cell-Mediated Immunity and TCR/CD28 Signaling. The Journal of Immunology. 186, 143-155 (2011).
  11. Lalani, A. I., Moore, C. R., Luo, C., Kreider, B. Z., Liu, Y., Morse, H. C., Xie, P. Myeloid Cell TRAF3 Regulates Immune Responses and Inhibits Inflammation and Tumor Development in Mice. The Journal of Immunology. 194, 334-348 (2015).
  12. Lee, S., Nguyen, M. T. Recent advances of vaccine adjuvants for infectious diseases. Immune Network. 15, 51-57 (2015).
  13. Gavin, A. L., Hoebe, K., Duong, B., Ota, T., Martin, C., Beutler, B., Nemazee, D. Adjuvant-enhanced antibody responses in the absence of toll-like receptor signaling. Science. 314, 1936-1938 (2006).
  14. Klinman, D. M., Currie, D., Gursel, I., Verthelyi, D. Use of CpG oligodeoxynucleotides as immune adjuvants. Immunological Reviews. 199, 201-216 (2004).
  15. Gan, S. D., Patel, K. R. Enzyme immunoassay and enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Investigative Dermatology. 133, 12 (2013).
  16. Shah, K., Maghsoudlou, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): the basics. British Journal of Hospital Medicine. 77, 98-101 (2016).
  17. Nencini, F., Pratesi, S., Petroni, G., Matucci, A., Maggi, E., Vultaggio, A. Assays and strategies for immunogenicity assessment of biological agents. Drug Development Research. 75, 4-6 (2014).
  18. Haber, E., Page, L. B., Richards, F. F. Radio immunoassay employing gel filtration. Analytical Biochemistry. 12, 163-172 (1965).
  19. Yalow, R. S., Berson, S. A. Immunoassay of endogenous plasma insulin in man. 1960. Obesity Research. 4, 583-600 (1996).
  20. Lequin, R. M. Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Clinical Chemistry. 51, 2415-2418 (2005).
  21. Wreghitt, T. G., Tedder, R. S., Nagington, J., Ferns, R. B. Antibody assays for varicella-zoster virus: comparison of competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), competitive radioimmunoassay (RIA), complement fixation, and indirect immunofluorescence assays. Journal of Medical Virology. 13, 361-370 (1984).
  22. Mathew, B. C., Biju, R. S., Thapalia, N. An overview of electrochemiluminescent (ECL) technology in laboratory investigations. Kathmandu University Medical Journal. 3, 91-93 (2005).
  23. Mikulskis, A., Yeung, D., Subramanyam, M., Amaravadi, L. Solution ELISA as a platform of choice for development of robust, drug tolerant immunogenicity assays in support of drug development. The Journal of Immunological Methods. 365, 38-49 (2011).
  24. Wadhwa, M., Bird, C., Dilger, P., Gaines-Das, R., Thorpe, R. Strategies for detection, measurement and characterization of unwanted antibodies induced by therapeutic biologicals. The Journal of Immunological Methods. 278, 1-17 (2003).
  25. Wolforth, J. B. Methods of Blood Collection in the Mouse. Laboratory Animals. 29, 47-53 (2000).
  26. Stunz, L. L., Busch, L. K., Munroe, M. E., Sigmund, C. D., Tygrett, L. T., Waldschmidt, T. J., Bishop, G. A. Expression of the Cytoplasmic Tail of LMP1 in Mice Induces Hyperactivation of B Lymphocytes and Disordered Lymphoid Architecture. Immunity. 21, 255-266 (2004).
  27. Xie, P. TRAF molecules in cell signaling and in human diseases. Journal of Molecular Signaling. 8, 7 (2013).
  28. Lalani, A. I., Zhu, S., Gokhale, S., Jin, J., Xie, P. TRAF molecules in inflammation and inflammatory diseases. Current Pharmacology Reports. 4, 64-90 (2018).
  29. Tate, J., Ward, G. Interferences in immunoassay. The Clinical Biochemist Reviews. 25, 105-120 (2004).
  30. Specter, S., Friedman, H. Age- and sex-related differences in antibody formation and blastogenic responsiveness of splenocytes from RIII mice developing virus-induced mammary adenocarcinoma. The Journal of the National Cancer Institute. 67, 1347-1351 (1981).
  31. Giefing-Kroll, C., Berger, P., Lepperdinger, G., Grubeck-Loebenstein, B. How sex and age affect immune responses, susceptibility to infections, and response to vaccination. Aging Cell. 14, 309-321 (2015).
  32. Kaminski, D. A., Stavnezer, J. Antibody class switching differs among SJL, C57BL/6 and 129 mice. International Immunology. 19, 545-556 (2007).
  33. Sellers, R. S., Clifford, C. B., Treuting, P. M., Brayton, C. Immunological variation between inbred laboratory mouse strains: points to consider in phenotyping genetically immunomodified mice. Veterinary Pathology. 49, 32-43 (2012).
  34. Conour, L. A., Murray, K. A., Brown, M. J. Preparation of animals for research–issues to consider for rodents and rabbits. Institute of Laboratory Animal Resources Journal. 47, 283-293 (2006).
  35. Vlkova, M., Rohousova, I., Hostomska, J., Pohankova, L., Zidkova, L., Drahota, J., Valenzuela, J. G., Volf, P. Kinetics of antibody response in BALB/c and C57BL/6 mice bitten by Phlebotomus papatasi. PLOS Neglected Tropical Diseases. 6, 1719 (2012).
  36. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172, 2731-2738 (2004).
  37. Ruane, D., Chorny, A., Lee, H., Faith, J., Pandey, G., Shan, M., Simchoni, N., Rahman, A., Garg, A., Weinstein, E. G., et al. Microbiota regulate the ability of lung dendritic cells to induce IgA class-switch recombination and generate protective gastrointestinal immune responses. The Journal of Experimental Medicine. 213, 53-73 (2016).
  38. Chorny, A., Puga, I., Cerutti, A. Innate signaling networks in mucosal IgA class switching. Advances in Immunology. 107, 31-69 (2010).
  39. Van Praet, J. T., Donovan, E., Vanassche, I., Drennan, M. B., Windels, F., Dendooven, A., Allais, L., Cuvelier, C. A., van de Loo, F., Norris, P. S., et al. Commensal microbiota influence systemic autoimmune responses. The EMBO Journal. 34, 466-474 (2015).
  40. Nguyen, Q. N., Himes, J. E., Martinez, D. R., Permar, S. R. The Impact of the Gut Microbiota on Humoral Immunity to Pathogens and Vaccination in Early Infancy. PLOS Pathogens. 12, 1005997 (2016).
  41. Jeevan-Raj, B. P., Robert, I., Heyer, V., Page, A., Wang, J. H., Cammas, F., Alt, F. W., Losson, R., Reina-San-Martin, B. Epigenetic tethering of AID to the donor switch region during immunoglobulin class switch recombination. The Journal of Experimental Medicine. 208, 1649-1660 (2011).
  42. Chen, Z., Getahun, A., Chen, X., Dollin, Y., Cambier, J. C., Wang, J. H. Imbalanced PTEN and PI3K Signaling Impairs Class Switch Recombination. The Journal of Immunology. 195, 5461-5471 (2015).
  43. Boboila, C., Yan, C., Wesemann, D. R., Jankovic, M., Wang, J. H., Manis, J., Nussenzweig, A., Nussenzweig, M., Alt, F. W. Alternative end-joining catalyzes class switch recombination in the absence of both Ku70 and DNA ligase 4. The Journal of Experimental Medicine. 207, 417-427 (2010).
  44. Shah, H. B., Koelsch, K. A. B-Cell ELISPOT: For the Identification of Antigen-Specific Antibody-Secreting Cells. Methods in Molecular Biology. 1312, 419-426 (2015).
  45. Bonsignori, M., Moody, M. A. Simultaneous Detection of Antigen-Specific IgG- and IgM-Secreting Cells with a B Cell Fluorospot Assay. Cells. 1, 15-26 (2012).
  46. Sasaki, Y., Derudder, E., Hobeika, E., Pelanda, R., Reth, M., Rajewsky, K., Schmidt-Supprian, M. Canonical NF-kappaB activity, dispensable for B cell development, replaces BAFF-receptor signals and promotes B cell proliferation upon activation. Immunity. 24, 729-739 (2006).
  47. Goodlad, J. R., Macartney, J. C. Germinal-center cell proliferation in response to T-independent antigens: a stathmokinetic, morphometric and immunohistochemical study in vivo. European Journal of Immunology. 25, 1918-1926 (1995).
  48. Xie, P., Poovassery, J., Stunz, L. L., Smith, S. M., Schultz, M. L., Carlin, L. E., Bishop, G. A. Enhanced Toll-like receptor (TLR) responses of TNFR-associated factor 3 (TRAF3)-deficient B lymphocytes. Journal of Leukocyte Biology. 90, 1149-1157 (2011).
  49. Kaku, H., Horikawa, K., Obata, Y., Kato, I., Okamoto, H., Sakaguchi, N., Gerondakis, S., Takatsu, K. NF-kappaB is required for CD38-mediated induction of C(gamma)1 germline transcripts in murine B lymphocytes. International Immunology. 14, 1055-1064 (2002).
  50. Dudley, D. D., Chaudhuri, J., Bassing, C. H., Alt, F. W. Mechanism and control of V(D)J recombination versus class switch recombination: similarities and differences. Advances in Immunology. 86, 43-112 (2005).
  51. Lange, H., Hecht, O., Zemlin, M., Trad, A., Tanasa, R. I., Schroeder, H. W., Lemke, H. Immunoglobulin class switching appears to be regulated by B-cell antigen receptor-specific T-cell action. European Journal of Immunology. 42, 1016-1029 (2012).
  52. Moore, C. R., Liu, Y., Shao, C. S., Covey, L. R., Morse, H. C., Xie, P. Specific deletion of TRAF3 in B lymphocytes leads to B lymphoma development in mice. Leukemia. 26, 1122-1127 (2012).
  53. Bergmann, B., Grimsholm, O., Thorarinsdottir, K., Ren, W., Jirholt, P., Gjertsson, I., Martensson, I. L. Memory B cells in mouse models. Scandinavian Journal of Immunology. 78, 149-156 (2013).
  54. McHeyzer-Williams, L. J., Milpied, P. J., Okitsu, S. L., McHeyzer-Williams, M. G. Class-switched memory B cells remodel BCRs within secondary germinal centers. Nature Immunology. 16, 296-305 (2015).
  55. Elgueta, R., Marks, E., Nowak, E., Menezes, S., Benson, M., Raman, V. S., Ortiz, C., O’Connell, S., Hess, H., Lord, G. M., et al. CCR6-dependent positioning of memory B cells is essential for their ability to mount a recall response to antigen. The Journal of Immunology. 194, 505-513 (2015).

Tags

– Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)- Immunoglobulin (Ig) Isotype- Thymus-dependent- Thymus-independent- B Cell Activation- Germinal Center- TNP-polysaccharide- Retro-orbital Bleeding- Ig Isotype-specific Capturing Antibodies- TNP-38BSA Antigen- TNP-3BSA Antigen- Blocking Buffer- Ig Isotype Standard
check_url/57843?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lalani, A. I., Zhu, S., Xie, P. Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay. J. Vis. Exp. (139), e57843, doi:10.3791/57843 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image