Инвазивный метод для активации мыши зубчатой извилине, высокой частоты стимуляции
Summary
Этот протокол показывает, как создать надежный метод HFS мышей. Нейронов в зубчатой извилине гиппокампа электрически стимулируется HFS прямо и косвенно в естественных условиях. Активность нейронов и молекулярных сигналов, изучаются c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивание, соответственно; Нейрогенез количественно Бромдезоксиуридин маркировки assay.
Abstract
ВЧ-электростимуляции (HFS), с помощью вживленных электродов, ориентации различных областях мозга, была доказана как эффективного лечения различных неврологических и психиатрических заболеваний. HFS в регионе глубокой мозга, также названный стимуляции глубоко мозга (DBS), становится все более важным в клинических испытаниях. Недавний прогресс в области высоких частот DBS (HF-DBS) хирургии начал распространяться возможность использования этой инвазивной техники в других ситуациях, например лечения депрессии расстройства (MDD), обсессивно-компульсивное расстройство (ОКР) и поэтому о.
Несмотря на эти расширения индикаций основных механизмов благотворное воздействие ВЧ-DBS остаются загадочными. Для решения этого вопроса, один из подходов заключается в использовании имплантированных электродов, которые редко активировать распределенных подгруппы нейронов, HFS. Сообщалось, что HFS в передние ядра таламуса может использоваться для лечения огнеупорных эпилепсии в клинике. Основные механизмы могут быть связаны с повышенной Нейрогенез и изменения активности нейронов. Таким образом мы заинтересованы в изучении физиологических изменений при обнаружении активности нейронов, а также нейрогенез в зубчатой извилине мыши (ГД) до и после лечения HFS.
В этой рукописи мы описываем методологий для HFS для активации ГД в мышей, прямо или косвенно и в острой или хронической форме. Кроме того, мы описываем подробный протокол для подготовки срезы мозга для c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивания для мониторинга активности нейронов и сигнализации активации и Бромдезоксиуридин (BrdU) маркировка для определения Нейрогенез после индукции HF-DBS. Активации нейронной активности и нейрогенез после лечения HF-DBS обеспечивает прямой нейробиологических доказательств и потенциальных терапевтических преимуществ. Особенно эта методология может быть модифицировать и применять другие заинтересованные мозга регионы такие как базальных ганглиев и subthalamic регионов для конкретных мозга расстройств в клинике.
Introduction
ВЧ-DBS является нейрохирургические технологии для электростимуляции в мозге, который был разработан с 1870-х1. В конце 80-х HFS был впервые использован как потенциал терапевтического вмешательства для болезни Паркинсона и расстройств, другие движения2. В последние несколько десятилетий ВЧ-DBS более широко используется в лечении расстройств мозга, которые в настоящее время неизлечимыми традиционная терапевтические стратегии. В частности, за счет повышения точности HFS электрода, весьма эффективные результаты, и минимальные побочные эффекты, расстройств головного мозга лечение HF-DBS значительно участились в последние десятилетия3,4, 5. К примеру ВЧ-DBS был одобрен США продуктов питания и медикаментов (FDA) для лечения болезни Паркинсона (PD), тип деменцией Альцгеймера, необходимо тремор и другие виды движения расстройства2,6, 7. в PD больных, уменьшается дофаминергической лекарства до 50% в течение8HF-DBS. Кроме успешного лечения двигательных расстройств ВЧ-DBS также продемонстрировал свои мощные эффекты в лечении психических заболеваний в клинике и когнитивных увеличения как хорошо2,9, 10 , 11. следует отметить, что исследования HFS для лечения других психиатрических расстройств находятся на различных стадиях, предлагая много обещание пациентов12.
Хотя многие исследования показали, что фокуса HFS имеет как местных, так и удаленных эффекты во всем мозг13, неврологические и молекулярных механизмов воздействия остаются недостижимой2,14. В клинике терапевтические ВЧ-DBS обычно применяется в долгосрочной манере для лечения болезни Паркинсона и хронической боли и т.д. возникновения многих мнений объяснить порожденных ВЧ-DBS лечения, среди которых одна возможность улучшения что текущий HFS модулирует нейрональных сетевой активности, вероятно, повторяющихся деполяризации аксоны вблизи электродов имплантированных HFS. Или, ВЧ-DBS могут изменить разряда выходных нейронов и прогнозируемых показателей. Кроме того, ВЧ-DBS могут привести долгосрочные синаптических изменений, включая долгосрочные потенцирование (LTP) и долгосрочные депрессии (LTD), которая может способствовать симптоматическое улучшение. Пока, до сих пор неясно ли HFS оказывает основные молекулярные события, которые регулируют сотовых процессов, таких как взрослый нейрогенез в естественных условиях. Несколько линий исследования показали, что HFS грызунов могут подражать аналогичный нейронных ответов клинически прикладной DBS15,16. Чтобы понять основных клеточных механизмов ВЧ-DBS, в этом исследовании, мы сначала настроить в естественных условиях HFS методологии мышей в острый (один день) или хроническим (пять дней) образом. Во-вторых мы создали активационного анализа методологии для определения изменения активности нейронов и нейрогенез после доставки ВЧ-DBS.
Учитывая, что нейрональных производство от нервных стволовых клеток обильные во время эмбрионального развития, но продолжается и во взрослой жизни, гиппокампа Субгранулярная зоны является одной из основных областей, где происходит нейрогенез. Процесс нейрогенез находится под влиянием многих физиологических и патологических факторов. В некоторых случаях эпилептические гиппокампа нейрогенез, резко снизилась в17,18. Кроме того один электросудорожной терапии может значительно увеличить производство нейронов в зубчатой извилине19. Эти наблюдения предполагают, что электрофизиологических деятельность играет важную роль в регуляции взрослых Нейрогенез и синаптической пластичности в Нейроны гиппокампа. Таким образом чтобы далее продемонстрировать воздействие ВЧ-DBS на активность нейронов и нейрогенез, сначала осуществляем иммуноокрашивания assay немедленного раннего гена (IEG) c-fos который является известным маркером краткосрочных нейронной активности, в результате опыт работы20. Notch1 сигнализации также обнаружен для мониторинга сигналов активации после доставки HFS,21,,22. Кроме того мы также обнаружить нейрональных производства BrdU маркировки анализ после индукции HF-DBS в различных формах, хотя BrdU пятнать может также быть маркера для глиогенез.
В настоящем исследовании две методологии HFS приспособлены для активации гиппокампа DG прямо и косвенно. Электрод имплантируется в ГД напрямую или имплантируется в медиальной перфорантных пути (PP), который отправляет прогнозы для активации нейронов ГД. Для ВЧ-DBS индукции программируемые стимулятором представлен непрерывное стимулирование через фиксированного электрода на голову мыши. Чтобы определить последствия HFS для активации нейронов и нейрогенез, мы обнаруживаем выражение c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивание и количество BrdU включены позитивные нейронов в регионе гиппокампа ГД, соответственно, после HFS лечение. В частности воздействие ВЧ-DBS на нейрогенез в ГД сравниваются между острой и хронической стимуляции манере, или между прямым и косвенным стимуляции образом, соответственно.
Protocol
Representative Results
Discussion
ВЧ-DBS техника широко используется как мощный инструмент для лечения многих неврологических расстройств с 1990 года. Пока ориентир работы HF-DBS является для лечения болезни Паркинсона и основных тремор, которая привлекла большое внимание и интерес как в клинике и научное сообщество. Сущест…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
При поддержке Фонда национальной естественных наук Китая грантов, 31522029, 31770929 и 31371149 (для Haitao Wu), программа 973 (2014CB542203) из программы государственного развития фундаментальных исследований Китая (чтобы Haitao Ву), и Грант Z161100000216154 от Пекин муниципального науки и технологии Комиссии (для Haitao Wu). Авторы благодарят всех членов Haitao Wu лаборатории за их поддержку и дискуссий. Авторы благодарны чрезвычайно уникальную Лю за его помощь в отладке аппарат.
Materials
| Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
| Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
| Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
| Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
| Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
| Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
| Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
| Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
| Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
| Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
| Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
| Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
| anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
| anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
| Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
| Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
| Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
| anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
| Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |
Referências
- Perlmutter, J. S., Mink, J. W. Deep brain stimulation. Annual Review of Neuroscience. 29, 229-257 (2006).
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Kohl, S., et al. Deep brain stimulation for treatment-refractory obsessive compulsive disorder: a systematic review. BMC Psychiatry. 14, 214 (2014).
- Schlaepfer, T. E., Bewernick, B. H., Kayser, S., Madler, B., Coenen, V. A. Rapid effects of deep brain stimulation for treatment-resistant major depression. Biological Psychiatry. 73 (12), 1204-1212 (2013).
- Fisher, R., et al. Electrical stimulation of the anterior nucleus of thalamus for treatment of refractory epilepsy. Epilepsia. 51 (5), 899-908 (2010).
- Greenberg, B. D., et al. Deep brain stimulation of the ventral internal capsule/ventral striatum for obsessive-compulsive disorder: worldwide experience. Molecular Psychiatry. 15 (1), 64-79 (2010).
- Kalia, S. K., Sankar, T., Lozano, A. M. Deep brain stimulation for Parkinson’s disease and other movement disorders. Current Opinion in Neurology. 26 (4), 374-380 (2013).
- Garcia, L., D’Alessandro, G., Bioulac, B., Hammond, C. High-frequency stimulation in Parkinson’s disease: more or less. Trends in Neurosciences. 28 (4), 209-216 (2005).
- Guercio, L. A., Schmidt, H. D., Pierce, R. C. Deep brain stimulation of the nucleus accumbens shell attenuates cue-induced reinstatement of both cocaine and sucrose seeking in rats. Behavioural Brain Research. 281, 125-130 (2015).
- Bossert, J. M., Marchant, N. J., Calu, D. J., Shaham, Y. The reinstatement model of drug relapse: recent neurobiological findings, emerging research topics, and translational research. Psychopharmacology (Berlin). 229 (3), 453-476 (2013).
- Grubert, C., et al. Neuropsychological safety of nucleus accumbens deep brain stimulation for major depression: effects of 12-month stimulation. The World Journal of Biological Psychiatry. 12 (7), 516-527 (2011).
- Lyons, M. K. Deep brain stimulation: current and future clinical applications. Mayo Clinic Proceedings. 86 (7), 662-672 (2011).
- McIntyre, C. C., Hahn, P. J. Network perspectives on the mechanisms of deep brain stimulation. Neurobiology of Disease. 38 (3), 329-337 (2010).
- Kringelbach, M. L., Green, A. L., Owen, S. L., Schweder, P. M., Aziz, T. Z. Sing the mind electric – principles of deep brain stimulation. European Journal of Neuroscience. 32 (7), 1070-1079 (2010).
- Toda, H., Hamani, C., Fawcett, A. P., Hutchison, W. D., Lozano, A. M. The regulation of adult rodent hippocampal neurogenesis by deep brain stimulation. Journal of Neurosurgery. 108 (1), 132-138 (2008).
- Selvakumar, T., Alavian, K. N., Tierney, T. Analysis of gene expression changes in the rat hippocampus after deep brain stimulation of the anterior thalamic nucleus. Journal of Visualized Experiments. (97), e52457 (2015).
- Hattiangady, B., Shetty, A. K. Implications of decreased hippocampal neurogenesis in chronic temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 49, 26-41 (2008).
- Hattiangady, B., Rao, M. S., Shetty, A. K. Chronic temporal lobe epilepsy is associated with severely declined dentate neurogenesis in the adult hippocampus. Neurobiology of Disease. 17 (3), 473-490 (2004).
- Madsen, T. M., et al. Increased neurogenesis in a model of electroconvulsive therapy. Biological Psychiatry. 47 (12), 1043-1049 (2000).
- Feldman, L. A., Shapiro, M. L., Nalbantoglu, J. A novel, rapidly acquired and persistent spatial memory task that induces immediate early gene expression. Behavioral and Brain Functions. 6, 35 (2010).
- Feng, S., et al. Notch1 deficiency in postnatal neural progenitor cells in the dentate gyrus leads to emotional and cognitive impairment. The FASEB Journal. 31 (10), 4347-4358 (2017).
- Alberi, L., et al. Activity-induced Notch signaling in neurons requires Arc/Arg3.1 and is essential for synaptic plasticity in hippocampal networks. Neuron. 69 (3), 437-444 (2011).
- Halpern, C. H., Attiah, M. A., Tekriwal, A., Baltuch, G. H. A step-wise approach to deep brain stimulation in mice. Acta Neurochirurgica.(Wien). 156 (8), 1515-1521 (2014).
- Batra, V., Guerin, G. F., Goeders, N. E., Wilden, J. A. A General method for evaluating deep brain stimulation effects on intravenous methamphetamine self-administration. Journal of Visualized Experiments. (107), e53266 (2016).
- Fluri, F., Bieber, M., Volkmann, J., Kleinschnitz, C. Microelectrode guided implantation of electrodes into the subthalamic nucleus of rats for long-term deep brain stimulation. Journal of Visualized Experiments. (104), e53066 (2015).
- Resendez, S. L., et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses. Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).
- Paxinos, G., Franklin, K. The mouse brain in stereotaxic coordinates. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, 3rd edition. 28 (03), 6 (2007).
- McHugh, T. J., et al. Dentate gyrus NMDA receptors mediate rapid pattern separation in the hippocampal network. Science. 317 (5834), 94-99 (2007).
- Gonzalez, C., et al. Medial prefrontal cortex is a crucial node of a rapid learning system that retrieves recent and remote memories. Neurobiology of Learning and Memory. 103, 19-25 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Tse, N., et al. The neuromuscular junction: measuring synapse size, fragmentation and changes in synaptic protein density using confocal fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (94), e52220 (2014).
- Pizzolato, G., Mandat, T. Deep brain stimulation for movement disorders. Frontiers in Integrative Neuroscience. 6, 2 (2012).
- Tierney, T. S., Sankar, T., Lozano, A. M. Some recent trends and further promising directions in functional neurosurgery. Acta Neurochirurgica Supplement. 117 (117), 87-92 (2013).
- Laxton, A. W., et al. A phase I trial of deep brain stimulation of memory circuits in Alzheimer’s disease. Annals of Neurology. 68 (4), 521-534 (2010).
- Min, H. K., et al. Deep brain stimulation induces BOLD activation in motor and non-motor networks: an fMRI comparison study of STN and EN/GPi DBS in large animals. NeuroImage. 63 (3), 1408-1420 (2012).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. . RNA sequencing and analysis. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Kawashima, T., Okuno, H., Bito, H. A new era for functional labeling of neurons: activity-dependent promoters have come of age. Frontiers in Neural Circuits. 8, 37 (2014).
- Liu, J., Solway, K., Messing, R. O., Sharp, F. R. Increased neurogenesis in the dentate gyrus after transient global ischemia in gerbils. Journal of Neuroscience. 18 (19), 7768-7778 (1998).
- Kuhn, H. G., Dickinson-Anson, H., Gage, F. H. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
