Lichte productie regelen bioluminescente bacterie via allerlei mechanismen, zoals quorum sensing. Deze nieuwe methode kan de behandeling in situ van bioluminescentie en de correlatie van licht emissie celdichtheid. Een kunstmatige bioluminescente Escherichia coli systeem maakt het mogelijk de karakterisatie van lux operons, Lux eiwitten en hun samenspel.
Er is een aanzienlijk aantal bacteriesoorten staat voor het uitstralen van licht. Allemaal delen hetzelfde gen cluster, namelijk de lux -operon. Ondanks deze gelijkenis vertonen deze bacteriën extreme variaties in kenmerken zoals het gedrag van de groei, de intensiteit van licht emissie of regulering van bioluminescentie. De methode die hier gepresenteerd is een nieuw ontwikkelde test die opname van celgroei en bioluminescente licht emissie-intensiteit na verloop van tijd met behulp van een afleesapparaat combineert. De hieruit voortvloeiende toename en lichte emissie kenmerken kunnen worden gekoppeld aan belangrijke kenmerken van de respectieve bacteriële stam, zoals quorum sensing verordening. De teelt van allerlei bioluminescente bacterie vereist een specifiek medium (bijvoorbeeld kunstmatige zee water medium) en temperaturen gedefinieerd. De gemakkelijk te hanteren, niet-bioluminescente standaard-onderzoek bacterie Escherichia coli (E. coli), aan de andere kant, kan worden gekweekt goedkoop in grote hoeveelheden in laboratoriumschaal. Exploitatie van E. coli door de invoering van een plasmide die met de hele lux operon proefomstandigheden kunt vereenvoudigen en bovendien opent vele mogelijkheden voor toekomstige toepassingen. De expressie van alle genen van de lux met behulp van een stam E. coli expressie werd bereikt door de bouw van een plasmide expressie via Gibson klonen en invoeging van vier fragmenten met zeven lux genen en drie rib genen van de lux-rib -operon in een pET28a-vector. E. coli gebaseerd lux genexpressie kan worden geïnduceerd en gecontroleerd via Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) toevoeging resulterend in bioluminescente E. coli cellen. De voordelen van dit systeem zijn gedefinieerd om te voorkomen dat quorum sensing verordening beperkingen en complexe middellange composities samen met niet-standaard groei-omstandigheden, zoals temperaturen. Dit systeem maakt een analyse van lux genen en hun samenspel, door de uitsluiting van het respectieve gen van het operon lux , of zelfs de toevoeging van nieuwe genen, uitwisseling van de genen van de luxAB van een bacteriële stam door een ander, of analyseren van eiwitcomplexen, zoals luxCDE.
De uitstoot van licht door levende organismen (bioluminescentie) is een fascinerend proces gevonden in bacteriën, schimmels, insecten, nematoden, vis en inktvis1. Bioluminescente licht emissie blijkt uit een chemiluminescentie reactie waarin chemische energie is (gedeeltelijk) omgezet in licht energie (“cold light”). In bioluminescente bacterie katalyseert de heterodimeric enzym luciferase de monooxygenation van lange keten, alifatische aldehyden, zoals tetradecanal, tegen het overeenkomstige zuren, begeleid door licht emissie met een maximum van 490 nm2, 3.
Figuur 1 : Algemene reactie regeling van bacteriële luciferase. De bacteriële luciferase (LuxAB) de monooxygenation van de lange ketting katalyseert aldehyden (CH3(CH2)nCHO) door gebruik te maken van verminderde flavine mononucleotide (FMNH2) en moleculaire zuurstof (O2), opbrengst van de producten lange ketting van zuren (CH3(CH2)nCOOH), flavine mononucleotide (FMN), water (H2O) en de emissie van licht gecentreerd op 490 nm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
De energie die vrijkomt tijdens deze oxidatie veroorzaakt een geëxciteerde toestand FMN-4a-hydroxide, die fungeert als het oplichtende luciferine4. De eiwitten die betrokken zijn bij bacteriële bioluminescentie, namelijk LuxCDABEG, worden gecodeerd door de lux -operon en zijn zeer behouden over verschillende bacteriestammen2,5. De genen geno – en luxB coderen voor de heterodimeric-luciferase; de luxC, de luxDpt luxE van genproducten zijn onderdelen van een vetzuur reductase complex; en luxG codeert voor een flavin reductase6. Een aantal bioluminescente Photobacteria (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) voeren de extra luxF -gen. Het was gemeld dat LuxF is een homodimeric eiwit dat de ongebruikelijke flavin afgeleide 6-(3′-(R)-myristyl bindt)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Extra genen zijn geïdentificeerd die verantwoordelijk voor riboflavine synthese (bijvoorbeeld ribEBH zijn) en bovendien regulatory genen hebben gemeld, die een rol spelen in het quorum sensing regulering van bioluminescentie, vooral voor Vibrio fischeri pt Vibrio harveyi6,13. Ondanks de zeer geconserveerde gene orde weergeven bioluminescente bacterie in kenmerken zoals het gedrag van de groei, de intensiteit van licht, of regulering van bioluminescentie2,5,14 hoge variaties .
Verschillende stammen of plasmiden die onderdelen bevatten die zijn gewijzigd of hele lux operons bekend zijn, benutten van bioluminescentie als verslaggever systemen. Verschillende toepassingen, zoals het bepalen van de activiteit van de promotor, toezicht op bacteriële besmettingen in milieu of voedsel monsters, bioluminescentie Resonance Energy Transfer (BRET), in vivo imaging van infecties in eukaryote organismen, waren gevestigde15,16,17pyrosequencing, enzovoort. Interessant is dat gebruikte de drie meest bioluminescente verslaggever systemen zijn afgeleid van de Noord-Amerikaanse firefly (Photinus pyralis), de darmen ziekteverwekkende agens van nematoden (Photorhabdus luminescens) en de zee viooltje (Renilla reniformis). Geen van die systemen heeft een bacteriële oorsprong, maar het gebruik van lux genen en operons van bacteriële oorsprong is het verkrijgen van meer belangstelling voor toegepast onderzoek16. De minder overvloedige toepassingvan bioluminescentie eiwitten uit bacteriële bronnen is voornamelijk te wijten aan lagere stabiliteit en levensduur van bacteriën afgeleid verlichte eiwitten die kunnen worden gerelateerd aan hun mariene habitats. Bioluminescente bacterie van mariene habitats zijn niet standaard lab voorwaarden cultuurgrond. Deze bacteriën vereisen specifieke groeisnelheid media en omstandigheden, zoals kunstmatige zee middellange en lagere groei/incubatie watertemperaturen (bijvoorbeeld 28 ° C).
Om te vereenvoudigen van de vergelijking van lux operon kenmerken of één lux genen van een aantal verschillende bioluminescente bacteriestammen, een methode om te standaardiseren lux operon expressie en analyse is een voorwaarde. Zo ontstond het idee de hele lux-rib -operon te integreren in de standaard-onderzoek bacterie Escherichia coli (E. coli). Voor dit doel, Gibson vergadering bleek te zijn een nuttig instrument om te integreren meerdere lineaire, overlappende fragmenten in één expressie vector zonder de behoefte aan specifieke beperkingsplaatsen. Deze methode is ook geschikt als DNA inserts te groot zijn (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operon grootte) kan worden versterkt via PCR. Een lux -operon in meerdere overlappende fragmenten kan worden gescheiden, zal vervolgens worden samengevoegd tot één expressie plasmide en ten slotte de volgorde gecontroleerd vergadering product kan direct worden omgezet in een juiste E. coli systeem voor hoge opbrengst eiwit expressie18,19,20. Naast de gemakkelijk te hanteren van E. coli gebaseerd lux genexpressie, bleef een eenvoudige methode combineren opname van celgroei en bioluminescente lichte emissie worden vastgesteld. De hier beschreven methode staat de in situ meting en de correlatie van de celdichtheid en lichte emissie van bioluminescente bacterie.
De analyse van de genen van de lux lux operon orde en regulering van diverse bioluminescente bacterie met aan de ene kant, een kunstmatige bioluminescente E. coli systeem met het hele lux-rib -operon van P. mandapamensis 27561 en aan de andere kant, een nieuw ontwikkelde plaat lezer assay voor het combineren van de opname in situ van de celdichtheid en lichte emissie, helpt bij het krijgen van meer informatie over de verschillende systemen van bacteriële lux . Deze fundamentele karakterisering en vergelijking van luciferases en verwante enzymen kunnen leiden tot alternatieven voor de reeds gevestigde verslaggever systemen met verbeterde stabiliteit en activiteit.
De bouw van een plasmide van de expressie met vier fragmenten componeren het hele lux-rib -operon van P. mandapamensis 27561 werd bereikt via Gibson klonen. Deze E. coli gebaseerd lux genexpressie kunt E. coli cellen licht uitstralen. Vermijden van quorum sensing verordening en niet-standaard groei voorwaarden zijn aanzienlijke voordelen van dit systeem.
De voordelen van het gebruik van Gibson klonen strategie zijn de eenvoudige montage van meerdere lineaire DNA-fragmenten, hoge flexibiliteit en geen behoefte aan specifieke beperking sites18,19,20. Deze methode kan om een lux -operon, met uitzondering van enkel gen of genen clusters of introductie van nieuwe genen of uitwisselen van genen van een stam met een ander gemakkelijk te veranderen. Een voorwaarde voor de toepassing van deze methode is de beschikbaarheid van de respectieve lux operon gensequentie. Slechts voor een klein aantal bioluminescente bacterie is de volledige opeenvolging van DNA van het respectieve lux -operon bekend en/of beschikbaar. Veel van deze sequenties zijn gefragmenteerd, omdat ze werden gegenereerd met behulp van shotgun sequencing. In het geval van de onderzochte P. mandapamensis 27561 de volledige opeenvolging van DNA van de lux -operon is bekend en beschikbaar uit de database van de gene NCBI (GenBank: DQ988878.2).
Een kritieke stap in het protocol van de Gibson-vergadering is de berekening van de DNA-concentratie van de fragmenten. In het protocol van de vergadering van de fabrikant het werd aanbevolen het gebruik van 0,2 – 0,5 pmols en een totaal volume van 20 µL voor 4-6 fragmenten20,21. In ons geval, waar luxCDABFEG-ribEBH uit 4 fragmenten bestaat, waren de concentratie en de totale hoeveelheden 0.1 pmol en 45 µL, respectievelijk, afhankelijk van de opbrengst van PCR producten. Aan de ene kant, de concentratie moest worden verminderd en aan de andere kant, het volume moest worden verhoogd. Niettemin, de vergadering gehanteerd welaan en DNA rangschikkend bevestigd het juiste inbrengen bij de eerste poging. Deze bevinding bevestigd Gibson vergadering als een robuuste en geschikte methode voor onze onderzoeken, die gemakkelijk gemodificeerde18,19,20 kunnen.
De nieuw opgerichte plaat lezer assay is een gemakkelijk te hanteren methode. Het maakt een eenvoudige primaire analyse van nieuwe of (on-) bekend bioluminescente bacteriestammen en geeft al een eerste hint op het reguleringsmechanisme van lichte productie (bijvoorbeeld lag in luminescentie op lage cel dichtheden). Daarnaast kunnen de groei voorwaarden in combinatie met lichte productie gemakkelijk worden geëvalueerd door simpelweg het veranderen van groeimedium of temperatuur.
De metingen met de afleesapparaat werden uitgevoerd bij 28 ° C. De reden voor deze ongebruikelijke instelling is de gevoeligheid van de temperatuur van bioluminescente bacteriestammen, waar temperaturen boven 30 ° C leiden tot minder of zelfs geen groei en/of licht emissie. Opmerking, dat de lezer van de plaat staat een gedefinieerde temperatuur houden na verloop van tijd met de beperking van een ontbrekende actieve koeling systeem is. Daarom moet de omgevingstemperatuur onder de temperatuur van de meting.
Als een bewijs van concept, een vergelijking van de constructie van de E. coli met de bioluminescente stam P. mandapamensis (Figuur 5) aan de ene kant en de referentiemetingen (Figuur 4) aan de andere kant werden uitgevoerd en bevestigen de betrouwbaarheid van deze nieuw opgerichte systeem. Daarnaast verzekerd het op lange termijn meten de levensduur van de lichte emissie (Figuur 6). Maar men moet overwegen dat OD-waarden niet betrouwbaar boven een bepaalde optische dichtheid, afhankelijk van de kenmerken van de gebruikte meting apparaat (ongeveer 15 h in het onderhavige geval zijn) waar een aangewezen verdunning nodig zou zijn voor een meting in de lineaire bereik van de detector. Deze hoge varianties in OD-waarden maken deze lange tijdmetingen niet betrouwbaar. Daarom zijn kortere metingen zoals 10u geadviseerd met behulp van de experimentele opstelling gemeld hier.
Beperkingen van de gevestigde plaat lezer bepaling kunnen worden gezien in Figuur 7. Het probleem is het vinden van een juiste instelling van de meting. De ‘krijgen waarde’ Hiermee past u de gevoeligheid van de foto multiplier buis (PMT). De winst is de versterking van het signaal in de bet, wat betekent dat een hogere winst factor het signaal zal toenemen. Als de winst te laag is ingesteld, de signaal / ruisverhouding groter wordt en lichte intensiteiten van de “lage” lichtend bioluminescente bacterie kunnen niet worden gemeten geen meer (signalen dicht bij nul, gegevens niet worden weergegeven). De uitdaging in een bioluminescente assay is om in te stellen van de winst, zodat de meetresultaten voor alle bacteriestammen binnen het bereik van het instrument blijven. Bovendien, het meetbereik voor luminescentie hangt af van de intervaltijd meting (bijvoorbeeld maximaal 2.000.000 voor 1 s).
De winst was ingesteld op 2800, die is empirisch getest en gekozen voor de lezer van de specifieke plaat die voor de opstelling van deze methode. De instelling van de gebruikte winst staat de opname van maximale uitgestraalde licht door de bioluminescente E. coli systeem, P. mandapamensis 27561 en P. mandapamensis S1 zonder overloop, maar voor de spanningen P. mandapamensis TH1 en V. harveyi 14126 de winst te hoog was. Daarom deze laatste stammen hoger zijn dan de detectiegrens en de echte maximale lichtintensiteit kan niet worden gemeten. Deze technische beperking kan verhinderen dat de vergelijking van bioluminescente bacteriën, die hoge variaties vertonen door maximale licht emissie, hoewel groei-omstandigheden en de bevolkingsdichtheid van de cel vergelijkbaar wellicht.
Positionering van de geanalyseerde bacteriestammen binnen de gebruikte goed platen moet empirisch worden geëvalueerd. Hoewel zwarte goed platen met glazen bodem werden gebruikt, werd Overspraak tussen de monsters waargenomen. De lichtsterkte van specifieke stammen is zo hoog, dat alle naburige putjes valse positieve licht uitstoot (b.v. leeg) zal tonen. Daarom is het belangrijk voor het meten van twee verschillende stammen, hetzij afzonderlijk of met een bepaalde ruimtelijke scheiding aan elkaar.
Er zijn al veel gemodificeerde E. coli stammen bekend die delen van de lux -operon bevatten en zijn voornamelijk toepassingsgericht15,16,17. De hier beschreven methoden gericht op het fundamenteel onderzoek, bijvoorbeeld de mogelijkheid van het analyseren van elk gen lux afzonderlijk. Hoewel onderzoek van bioluminescentie een lange geschiedenis heeft, zijn er nog veel open vragen. Door met uitzondering van invoering van genen uit het operon lux , de luxAB genen met genen van een andere stam uit te wisselen of analyseren van eiwitten complexen, ingebed in het gemakkelijk te hanteren systeem van E. coli en verdere toepassing van de plaat lezer assay, het mogelijk te krijgen meer informatie over de regelgeving en de functies van lux genen.
The authors have nothing to disclose.
We willen Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) bedanken voor zijn steun bij de oprichting van het zelfgeschreven script voor de afleesapparaat. Dit werk werd gesteund door de Oostenrijkse “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) tot uur (P24189) en het PhD-programma “DK Moleculaire enzymologie” (W901) tot uur.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up kit | Promega | A9282 | for 250 rxn |
Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
GeneJet Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0503 | for 250 rxn |
GoTaq G2 DNA Polymerase | Promega | M7841 | |
24-well black sensoplate with glass bottom | Greiner Bio One | 662892 | |
FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
Multitron Standard Incubator Shaker | Infors AG |