I batteri bioluminescenti regolano la produzione di luce attraverso una varietà di meccanismi, come quorum sensing. Questo nuovo metodo consente l’indagine in situ della bioluminescenza e la correlazione di emissione luminosa di densità delle cellule. Un artificiale bioluminescenti Escherichia coli sistema permette la caratterizzazione di operoni lux , Lux proteine e loro interazione.
C’è un numero considerevole di specie batteriche in grado di emettere luce. Tutti condividono lo stessa cluster genico, vale a dire l’operone lux . Nonostante questa somiglianza, questi batteri mostrano variazioni estreme di caratteristiche come comportamento di sviluppo, l’intensità dell’emissione luminosa o regolamento della bioluminescenza. Il metodo presentato qui è un saggio di nuova concezione che combina la registrazione di crescita delle cellule e l’intensità di emissione di luce bioluminescente nel tempo utilizzando un lettore di piastra. La conseguente crescita e le caratteristiche di emissione luminosa possono essere collegate alle funzioni importanti del ceppo batterico rispettivo, come ‘ quorum sensing regolamento. La coltivazione di una gamma di batteri bioluminescenti richiede un supporto specifico (ad es., mezzo di acqua di mare artificiale) e definito le temperature. La facile da maneggiare, non bioluminescenti standard-ricerca batterio Escherichia coli (Escherichia coli), d’altra parte, può essere coltivata a buon mercato in elevate quantità in scala di laboratorio. Sfruttare la Escherichia coli introducendo un plasmide contenente l’ intero lux operone può semplificare le condizioni sperimentali e inoltre apre molte possibilità per le future applicazioni. L’espressione di tutti i geni di lux utilizzando un ceppo di e. coli espressione è stata realizzata tramite la costruzione di un plasmide di espressione tramite clonazione di Gibson e l’inserimento di quattro frammenti contenenti sette geni lux e tre geni di costola di l’operone lux-nervatura in un vettore di pET28a. Espressione genica di e. coli basato lux può essere indotta e controllato tramite aggiunta di isopropile-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) conseguente bioluminescenti Escherichia coli cellule. I vantaggi di questo sistema sono per evitare ‘ quorum sensing regolamento restrizioni e composizioni complesse medie insieme a condizioni di crescita non standard, come definito temperature. Questo sistema consente l’analisi dei geni di lux e la loro interazione, mediante l’esclusione del gene del rispettivo dall’operone lux , o anche aggiunta di nuovi geni, lo scambio di geni da un ceppo batterico luxAB da un altro, o analisi dei complessi della proteina, ad esempio luxCDE.
L’emissione di luce da organismi viventi (bioluminescenza) è un processo affascinante trovato in batteri, funghi, insetti, nematodi, pesci e calamari1. Emissione di luce bioluminescente emerge da una reazione di chemiluminescenza in cui energia chimica (parzialmente) si trasforma in energia luminosa (“luce fredda”). In batteri bioluminescenti, heterodimeric enzima luciferasi catalizza la monooxygenation della lunga catena, aldeidi alifatiche, come tetradecanal, agli acidi corrispondenti accompagnata da emissione di luce con un massimo a 490 nm2, 3.
Figura 1 : Schema di reazione generale di luciferasi batterica. La luciferasi batterica (LuxAB) catalizza la monooxygenation della lunga catena di aldeidi (CH3(CH2)nCHO) utilizzando ridotto mononucleotide di flavin (FMNH2) e ossigeno molecolare (O2), producendo i prodotti a catena lunga acidi (CH3(CH2)nCOOH), flavina mononucleotide (FMN), acqua (H2O) e l’emissione di luce centrato a 490 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
L’energia rilasciata durante questa ossidazione provoca uno stato eccitato FMN-4a-idrossido, che serve come la luce che emettono luciferina4. Le proteine coinvolte nella batterica bioluminescenza, vale a dire LuxCDABEG, sono codificati dall’operone lux e sono altamente conservati nel corso di vari ceppi batterici2,5. I geni luxA e luxB codificare per la luciferasi heterodimeric; prodotti del gene di luxC, di luxDe di luxE sono componenti di una riduttasi di acido grasso complessa; e luxG codifica per una Flavina reduttasi6. Un numero di bioluminescenti sulfurei (e.g.,Photobacterium mandapamensis 27561) portatori del gene di ulteriori LUF . È stato riferito che LUF è una proteina omodimerica che lega la flavina insolito derivato 6-(3′-(R)-miristil)-FMN (myrFMN)7,8,9,10,11 ,12. Sono stati identificati altri geni che sono responsabili per la sintesi di riboflavina (ad esempio, ribEBH) e inoltre sono stati segnalati geni regolatori, che svolgono un ruolo nel quorum regolamento rilevamento della bioluminescenza, soprattutto per del vibrione fischeri e Vibrio harveyi6,13. Nonostante l’ordine di gene altamente conservata, batteri bioluminescenti mostrano forti variazioni nelle caratteristiche come comportamento di sviluppo, l’intensità dell’emissione luminosa, o regolamento di bioluminescenza2,5,14 .
Molti modificati ceppi o plasmidi contenenti parti o interi lux operoni sono noti, sfruttando la bioluminescenza come sistemi reporter. Varie applicazioni ad esempio per determinare l’attività del promotore, monitoraggio di contaminazioni batteriche in ambiente o campioni di alimenti, bioluminescenza Resonance Energy Transfer (BRET), in vivo imaging delle infezioni negli organismi eucarioti, Pyrosequencing e così via sono stati stabiliti15,16,17. È interessante notare che, i tre più frequentemente utilizzati reporter bioluminescenti sistemi sono derivati da firefly nordamericano (Photinus pyralis), l’agente patogeno enterico di nematodi (Photorhabdus luminescens) e la viola di mare (Renilla reniformis). Nessuno di questi sistemi è di origine batterica, ma l’uso di geni di lux e operons dalle origini batteriche sta guadagnando più interesse per la ricerca applicata16. L’applicazione meno abbondante delle proteine di bioluminescenza da fonti batteriche è principalmente a causa della bassa stabilità e longevità dei batteri derivati luminescenti proteine che possono essere connesse al loro habitat marini. I batteri bioluminescenti degli habitat marini non sono coltivabili in condizioni di laboratorio standard. Questi batteri richiedono mezzi specifici di sviluppo e condizioni, quali artificiali mare acqua media e bassa crescita/temperature d’incubazione (ad es., 28 ° C).
Per semplificare il confronto delle caratteristiche di operone lux o singola lux geni di una gamma di differenti ceppi batterici bioluminescenti, un metodo per standardizzare l’analisi e l’espressione di operone lux è un prerequisito. Così, l’idea di integrare l’operone intero lux-nervatura il batterio Escherichia coli (Escherichia coli) di standard-ricerca emerse. Per questo scopo, Assemblea di Gibson si è rivelata uno strumento utile per integrare frammenti multipli lineari, sovrapposti nel vettore di uno espressione senza la necessità di siti di restrizione specifici. Questo metodo è adatto anche quando inserti di DNA sono troppo grandi (e.g.,P. mandapamensis 27561 luxCDABFEG-ribEBH; ~ 9 kb operone size) per essere amplificato tramite PCR. Un operone lux può essere suddivisa in più frammenti sovrapposti, poi essere assemblati in plasmide un’espressione e infine la sequenza verificato prodotto di montaggio può essere trasformato direttamente in un appropriato Escherichia coli sistema per ad alto rendimento proteina espressione18,19,20. Oltre la facile trattare l’espressione genica di e. coli basato lux , un metodo semplice che combina la registrazione di crescita delle cellule e di emissione di luce bioluminescente è rimasto per essere stabilito. Il metodo qui descritto consente la misura in situ e la correlazione di densità delle cellule e di emissione di luce di batteri bioluminescenti.
L’analisi dei geni di lux e ordine operone lux e regolazione di vari batteri bioluminescenti con, da un lato, un artificiale bioluminescenti Escherichia coli sistema contenente l’operone intero lux-costola di P. mandapamensis 27561 e, da altro lato, un’analisi di lettore di piastra di nuova concezione che combina la registrazione in situ di densità delle cellule e di emissione di luce, aiuta ad per acquisire ulteriori informazioni sui vari sistemi batterici lux . Questa caratterizzazione fondamentale e confronto di luciferasi ed enzimi correlati può portare a alternative ai sistemi già affermati reporter con attività e una maggiore stabilità.
La costruzione di un plasmide di espressione contenente quattro frammenti che compongono l’operone intero lux-costola di mandapamensis p. 27561 è stata realizzata via Gibson clonazione. Questa espressione genica di e. coli basato lux permettono alle cellule di Escherichia coli emettere luce. Evitando ‘ quorum sensing regolamento e le condizioni di crescita non standard sono notevoli vantaggi di questo sistema.
I vantaggi di usando strategia clonazione Gibson sono la facilità di montaggio di più frammenti di DNA lineari, alta flessibilità e senza necessità di restrizione specifici siti18,19,20. Questo metodo consente di cambiare facilmente un operone lux , esclusione di singoli geni o cluster genici o l’introduzione di nuovi geni o lo scambio di geni da un ceppo con un altro. Un prerequisito per l’applicazione di questo metodo è la disponibilità della sequenza del gene di operone rispettivi lux . Solo per un piccolo numero di batteri bioluminescenti è l’intera sequenza di DNA dell’operone rispettivi lux noti e/o disponibili. Molte di queste sequenze sono frammentati perché siano generate mediante sequenziamento shotgun. Nel caso l’indagato mandapamensis p. 27561 l’intera sequenza di DNA dell’operone lux è noto e disponibile dal database NCBI gene (GenBank: DQ988878.2).
Un passo critico nel protocollo dell’Assemblea di Gibson è il calcolo della concentrazione del DNA dei singoli frammenti. Nel protocollo di montaggio del produttore è stato consigliato di utilizzare 0,2 – 0,5 pmols e un volume totale di 20 µ l per 4-6 frammenti20,21. Nel nostro caso, dove luxCDABFEG-ribEBH è composto da 4 frammenti, le concentrazioni e volumi totali erano pmol 0.1 e 45 µ l, rispettivamente, a seconda del rendimento dei prodotti di PCR. Da un lato, la concentrazione doveva essere ridotto e d’altra parte, il volume doveva essere aumentata. Tuttavia, l’Assemblea ha lavorato molto bene e sequenziamento del DNA ha confermato l’inserimento corretto al primo tentativo. Questa scoperta ha confermato assembly Gibson come un metodo robusto e adatto per le nostre indagini, che possono essere facilmente modificate18,19,20.
L’analisi del lettore neoformata piatto è un facile da gestire metodo. Consente una semplice analisi primaria di nuovo o (ONU-) noto ceppi batterici bioluminescenti e dà già un primo accenno sul meccanismo di regolamentazione della produzione di luce (ad es., ritardo a luminescenza a densità bassa delle cellule). Inoltre, le condizioni di crescita in combinazione con la produzione di luce possono essere valutate facilmente semplicemente cambiando crescita medio o temperatura.
Con il lettore di piastra sono state effettuate a 28 ° C. La ragione di questa impostazione insolita è la sensibilità di temperatura di ceppi di batteri bioluminescenti, dove le temperature superiori ai 30 ° C portano a meno o addirittura nessuna crescita e/o emissione di luce. Notare che il lettore è in grado di mantenere una temperatura definita nel corso del tempo con la limitazione della mancanza di un sistema di raffreddamento attivo. Pertanto, la temperatura ambiente deve essere inferiore alla temperatura di misura.
Come un proof of concept, il confronto tra il costrutto di Escherichia coli con il ceppo bioluminescente p. mandapamensis (Figura 5) su un lato e le misure di riferimento (Figura 4) d’altra parte sono stati eseguiti e confermare l’affidabilità di questo sistema di nuova costituzione. Inoltre, la misurazione a lungo termine ha assicurato la longevità dell’emissione luminosa (Figura 6). Ma si deve considerare che i valori OD non sono affidabili di sopra una certa densità ottica, a seconda delle caratteristiche del dispositivo di misura usato (circa 15 h nel caso di specie) dove sarebbe necessaria una diluizione appropriata per una misura nella della gamma lineare del rivelatore. Queste varianze alte in valori OD rendono queste misure di lungo periodo di tempo non affidabile. Misure più corte come 10h si raccomanda pertanto utilizzando la messa a punto sperimentale segnalato qui.
Limitazioni del test lettore piastra stabilito possono essere visto nella Figura 7. La difficoltà consiste nel trovare un’impostazione appropriata della misurazione. Il valore di guadagno regola la sensibilità del tubo fotomoltiplicatore (PMT). Il guadagno è l’amplificazione del segnale in PMT, significato che un fattore di guadagno superiore aumenterà il segnale. Se il guadagno è impostato troppo basso, il rapporto segnale-rumore diventa più grande e intensità di luce di batteri bioluminescenti splendenti “bassi” non può essere misurata (eventuali segnali più vicino allo zero, dati non indicati). La sfida in un’analisi bioluminescente è impostare il guadagno quindi i risultati di misura per tutti i ceppi batterici rimanere all’interno della gamma dello strumento. Inoltre, la gamma di misurazione per luminescenza dipende il tempo di intervallo di misurazione (ad es., massimo di 2.000.000 per 1 s).
Il guadagno è stato impostato a 2800, empiricamente, che è stato testato e scelto per il lettore di piastra specifica utilizzato per l’istituzione di questo metodo. L’impostazione del guadagno usato permette la registrazione di massima luce emessa dalla bioluminescenti sistema di Escherichia coli , mandapamensis p. 27561 e p. mandapamensis S1 senza un overflow, ma per i ceppi di p. mandapamensis TH1 e V. harveyi 14126 il guadagno era troppo alto. Di conseguenza, questi ceppi di quest’ultimi superino il limite di rilevamento e l’intensità della luce reale massima non può essere misurato. Questa limitazione tecnica potrebbe impedire il confronto di batteri bioluminescenti, che mostrano forti variazioni nella massima emissione luminosa, anche se le condizioni di crescita e densità delle cellule potrebbe essere paragonabile.
Posizionamento dei ceppi batterici analizzati entro i piatti usati bene deve essere valutata empiricamente. Sebbene neri piastre a pozzetti con fondo in vetro sono stati utilizzati, diafonia tra i campioni è stata osservata. L’intensità della luce di ceppi specifici è così alta, che tutti i pozzi vicini mostrerà false positive emissioni luminose (ad es., vuoto). Pertanto, è importante misurare due diversi ceppi sia separatamente che con una certa separazione spaziale a vicenda.
Ci sono già molti ceppi di e. coli conosciuti che contengono parti dell’operone lux per l’ultima volta e sono principalmente orientate all’applicazione15,16,17. I metodi descritti qui, mirano a ricerca fondamentale, ad esempio la possibilità di analizzare ciascun gene lux separatamente. Anche se la ricerca della bioluminescenza ha una lunga storia, ci sono ancora molte questioni aperte. Escluse o introducendo geni dall’operone lux , lo scambio di geni luxAB con geni di un altro ceppo, o analizzare proteina complessi, incorporato nel facile gestire il sistema di e. coli e ulteriore applicazione della piastra analisi di lettore, potrebbe essere possibile ottenere ulteriori informazioni sui processi di regolamentazione e le funzioni dei geni di lux .
The authors have nothing to disclose.
Vogliamo ringraziare Wladislaw Maier (BMG Labtech GmbH) per il suo sostegno nell’instaurazione lo script auto-scritto per il lettore di piastra. Questo lavoro è stato sostenuto dagli austriaci “Fonds zur Förderung der wissenschaftlichen Forschung” (FWF) a PM (P24189) e il programma di dottorato di ricerca “DK enzimologia molecolare” (W901) al PM.
NEBuilder High-Fidelity DNA Assembly Cloning Kit | New England Biolabs Inc. | E2621S | for 10 rxn dx.doi.org/10.17504/protocols.io.cwaxad |
Phusion Polymerase | Thermo Scientific | F530S | |
Q5 High Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs Inc. | M0491S | |
GeneJet Genomic DNA Purififcation Kit | Thermo Scientific | K0721 | for 50 rxn |
Restriction enzymes and buffer (NcoI, XhoI) | New England Biolabs Inc. | R3193S/R0146S | |
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Monarch DNA Gel Extraction Kit | New England Biolabs Inc. | #T1020S | for 50 rxn |
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FLUOStar Omega plate reader | BMG Labtech | ||
OPTIMA/Mars Analysis Software | BMG Labtech | Version 2.20 | |
Microsoft Excel 2010 | Microsoft | ||
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