Production et la visualisation des sphéroplastes bactériennes et de protoplastes de caractériser Peptide antimicrobien localisation
Summary
Nous présentons ici un protocole pour produire des Gram négatif Escherichia coli (e.coli) sphéroplastes et Gram positif Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastes pour visualiser clairement et rapidement caractériser interactions peptide-bactéries. Cela fournit une méthode systématique pour définir la membrane localisation et translocation des peptides.
Abstract
L’utilisation de la microscopie confocale comme une méthode pour évaluer les modèles de localisation de peptide au sein de bactéries est généralement inhibée par les limites de résolution des microscopes légers classiques. Comme la résolution d’un microscope donnée ne peut être facilement améliorée, nous présentons des protocoles afin de transformer le petit bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) en plus, facilement imagés des formes sphériques appellent sphéroplastes ou protoplastes. Cette transformation permet aux observateurs de rapidement et clairement déterminer si les peptides se loger dans la membrane bactérienne (c.-à-d., localisation de membrane) ou traversent la membrane pour entrer dans la cellule (c.-à-d., translocation). Avec cette approche, nous présentons aussi une méthode systématique pour caractériser les peptides comme membrane de localisation ou de translocation. Bien que cette méthode peut être utilisée pour une variété de peptides actifs membrane et souches bactériennes, nous démontrent l’utilité de ce protocole en observant l’interaction de Buforin II P11A (BF2 P11A), un peptide antimicrobien (AMP), à e. coli sphéroplastes et b. megaterium protoplastes.
Introduction
Peptides antimicrobiens (ampères) ont attiré l’attention en raison de leur utilisation potentielle comme alternatives aux antibiotiques conventionnels1,2,3,4,5. Ampères tuent les bactéries soit translocation à travers la membrane cellulaire et en interaction avec des composants intracellulaires tels que les acides nucléiques ou de perméabiliser la membrane provoquer des fuites de cellule contenu6. Outre leur utilisation comme les antibiotiques, les ampères de translocation peut-être être adaptée pour les demandes de livraison de drogue parce qu’ils peuvent traverser sans interruption de la membrane cellulaire imperméable7,8. Nous, donc, chercher à comprendre les mécanismes fondamentaux d’AMP d’action pour jeter les bases pour leur utilisation dans la conception de médicaments.
Microscopie confocale offre un moyen d’évaluer les modèles de localisation des amplis fluorescent étiquetés dans des cellules bactériennes pour mieux comprendre leur mécanisme d’action9,10,11,12, 13 , 14. par marquage de la membrane des bactéries, on peut déterminer si un peptide fluorescent étiqueté se localise à la membrane ou l’espace intracellulaire d’une cellule bactérienne. Cependant, cette technique est limitée par la petite taille et la tige forme des bactéries, ce qui peut rendre difficile en raison des limites de résolution des microscopes lumière conventionnelles et l’orientation variable des bactéries sur la diapositive15d’imagerie.
L’objectif de la méthode présentée est de permettre d’améliorer la visualisation des modèles de localisation peptide fluorescent étiquetés à l’aide de la microscopie confocale. Visualisation est renforcée en tournant la petite, mince, en forme de bâtonnet Gram-négatif Escherichia coli (e. coli) et Gram-positives Bacillus megaterium (b. megaterium) bactéries dans des formes sphériques, élargies dénommé sphéroplastes (pour les souches Gram-négatifs) et protoplastes (pour les souches Gram positifs)16,17,18,19,20,21. Sphéroplastes et protoplastes sont plus faciles à l’image à cause de leur augmentation de la taille et leur forme symétrique, ce qui rend l’orientation d’une bactérie sur une lame non pertinents pour son imagerie. En outre, nous présentons une approche systématique pour analyser quantitativement les données de microscopie confocale afin de caractériser les amplis comme une membrane localisation ou de translocation. Application de ces méthodes rend plus facile à distinguer fluorescent étiqueté modèles de localisation de peptide. Les protocoles présentés ici peuvent servir à évaluer la localisation d’une variété de membrane active agents autres que les amplis, y compris les peptides de pénétration cellulaire.
Un avantage de cette technique est qu’il permet de mieux comprendre le mécanisme d’action des amplis sur le plan de cellule unique, qui peut révéler la hétérogénéité de cellule-à15, par opposition à d’autres essais de fluorescence communément utilisé pour identifier les mécanismes d’action des amplis, qui fournissent seulement en vrac estimations9,22,23,24,25. L’utilisation de sphéroplastes et de protoplastes afin d’évaluer l’entrée de cellule de AMP est notamment utile26 parce qu’ils sont plus physiologiquement pertinents15 que les autres modèles utilisés pour évaluer l’entrée de cellule, tels que les lipides vésicules24.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles présentés ici rendent possible pour les chercheurs d’obtenir plus rapidement grandes tailles d’échantillon d’images bactériennes parce que les bactéries sphériques, élargies sont beaucoup plus faciles à repérer, orienter et l’image. Cette capacité accrue pour recueillir des données est utile à plusieurs égards. Tout d’abord, elle permet une analyse quantitative plus systématique des schémas de localisation de peptide. Alors que les tendances qualitatives peuvent démontrer de plus …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Recherche a été financée par l’Institut National des allergies et maladies infectieuses (NIAID-NIH) prix R15AI079685.
Materials
| Trizma hydrocloride (Tris HCl) | Sigma | T3253 | |
| Trizma base (Tris OH) | Sigma | T1503 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | 106361 | Used Sigma 106361 in original protocol development; 106361 discontinued with ED2SS as replacement |
| Cephalexin hydrate | Sigma | C4895 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760 | |
| BBL Trypticase soy broth | Fisher Scientific | B11768 | |
| BF2 P11A FITC | NeoScientific | Custom ordered | |
| di-8-ANEPPS | Biotium | 61012 | |
| DMSO | Sigma | 34869 | Used Sigma D8779 in original protocol development; D8779 discontinued with 34869 as replacement |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Acrodisc 25 mm Syringe Filter w/ 0.2 μm HT Tuffryn Membrane | Pall Corporation | 4192 | |
| Laser scanning confocal microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 II | For image acquisition |
| Leica Application Suite, Advanced Fluorescence | Leica Microsystems | For image processing |
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