Hier beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Herzzellen aus einem Rattenmodell der metabolischen Syndrom im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion. Eine manuelle Regelung der Intraluminal Druck von kardialen Hohlräumen wird implementiert, um funktionell intakt Myozyten geeignet für Erregung-Kontraktion-Kupplung Studien ergeben.
In diesem Artikel beschreiben wir eine optimierte, Langendorff-basierte Verfahren zur Isolierung von einzelligen Vorhofflimmern Kardiomyozyten (ACMs) aus einem Rattenmodell des metabolischen Syndroms (MetS)-im Zusammenhang mit Herzinsuffizienz mit erhaltener Auswurffraktion (HFpEF). Die Prävalenz der MetS-bezogenen HFpEF steigt, und Vorhofflimmern Kardiomyopathien Vorhofflimmern Umbau und Vorhofflimmern zugeordnet sind klinisch sehr relevant, da Vorhofflimmern Umbau ein unabhängiger Prädiktor für die Mortalität ist. Studien mit isolierten einzellige Herzzellen werden häufig verwendet, zu bestätigen und in-Vivo -Befunde zu ergänzen. Herz-Kreislauf-Gefäß-Rarefication und interstitiellen Gewebe Fibrose stellen einen potenziell limitierenden Faktor für die erfolgreiche einzellige Isolation der asbesthaltiger aus Tiermodellen der Krankheit.
Wir haben dieses Problem behoben, durch den Einsatz eines Geräts manuell Regeln des Intraluminal Drucks der kardialen Hohlräume bei der Isolierung im wesentlichen Erhöhung der Ausbeute von morphologisch und funktionell intakt ACMs. Die gewonnenen Zellen können in einer Vielzahl von verschiedenen Experimenten, wie Zellkultur und funktionelle Bildgebung von Calcium (d.h. Erregung-Kontraktion-Kupplung) verwendet werden.
Die Forscher bieten wir eine Schritt für Schritt-Protokoll, eine Liste von optimierten Lösungen, genaue Anweisungen zur Vorbereitung der notwendigen Ausrüstung und eine umfassende Anleitung zur Fehlerbehebung. Während die erste Implementierung des Verfahrens würde schwierig sein, können eine erfolgreiche Anpassung den Leser State-of-the-Art-ACM-Isolationen in einem Rattenmodell der MetS-bezogenen HFpEF für ein breites Spektrum an Experimente durchführen.
MetS beschreibt eine Ansammlung von Risikofaktoren für Diabetes Mellitus Typ 2 und Herz-Kreislauf-Erkrankungen und enthält einen erhöhte arteriellen Blutdruck, Fettstoffwechselstörungen (Triglyceride angehoben und abgesenkt High-density-Lipoprotein-Cholesterin), erhöhte Fasten Glukose und zentrale Adipositas1. Die weltweite Prävalenz des MetS wird voraussichtlich 25 – 30 % und stetig steigende2sein. HFpEF ist ein heterogenes klinisches Syndrom oft im Zusammenhang mit MetS. Kardialen remodeling während HFpEF und seiner vorhergehenden Phasen (z.B. Hypertensive Herzkrankheit) einher geht auch eine Umgestaltung der Atrien3. Reduzierte KONTRAKTILE Funktion und strukturelle Veränderungen des linken Vorhofs wurden mit erhöhter Mortalität, Vorhofflimmern und neue einsetzende Herzinsuffizienz4verbunden. Vorhofflimmern Umbau zeichnet sich durch Änderungen in der Ionen-Kanal-Funktion, Ca2 + Homöostase, Vorhofflimmern Struktur, Aktivierung der Fibroblasten und Gewebe Fibrose5. Links Vorhofflimmern Umbau in MetS-bezogene HFpEF und die zugrunde liegenden pathogenen Mechanismen sind noch kaum erforscht und erfordern eine weitere eingehende Untersuchung. Tiermodellen haben gezeigt, dass ein wertvolles Instrument und führen zu viele Fortschritte auf dem Gebiet von Vorhofflimmern Kardiomyopathien6,7,8,9.
Studien mit isolierten einzellige Herzzellen werden häufig verwendet, zu bestätigen und in-Vivo -Befunde zu ergänzen. Eine Isolation und die mögliche spätere Zellkultur ermöglichen die Untersuchung der Signalisierung Bahnen, Ionische Kanal Ströme und Anregung-Kontraktion-Kupplung. Unter physiologischen Bedingungen Herzzellen nicht vermehren. Die Fusion zwischen die transkriptionellen regulatorischen Sequenzen Atrial Natriuretic Faktor und ein simian Virus 40 große T-Antigen bei transgenen Mäusen führte zu die Kreation der ersten verewigt asbesthaltiger Namen AT-1-10. Die Weiterentwicklung des AT-1-Zellen führte zu HL-1-Zellen, die können nicht nur seriell passagiert aber auch Vertrag spontan11. Sie zeigen jedoch strukturelle und funktionelle Unterschiede im Vergleich zu frisch isolierte Zellen, wie z. B. eine weniger organisierten Ultrastruktur, ein hohes auftreten Myofibrillen11und eine Hyperpolarisation aktiviert nach innen aktuelle12zu entwickeln. Die Isolation der ventrikulären Kardiomyozyten (VCM) bei Ratten und Mäusen aus einer Vielzahl von Modellen ist gut etablierte13,14,15,16,17,18 , 19. im allgemeinen ausgeschnittenen Herzen ist montiert auf einem Langendorff-Apparat und doppelthebel durchströmt mit Ca2 +-freie Puffer, enthält Verdauungsenzyme, wie Collagenases und Proteasen. Kalzium ist in gewissem Sinne schrittweise an die physiologischen Bedingungen dann wieder eingeführt. Jedoch obwohl widmet sich die Isolierung der asbesthaltiger Protokolle verfügbar20,21, aufgrund der erhöhten Fibrose und Druck-bezogene Unterschiede sind beschränkt sich ihre Nützlichkeit in Krankheitsmodellen mit der Umgestaltung von Vorhofflimmern.
In diesem Artikel haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Vorhofflimmern einzellige Herzzellen von Tieren umgesetzt, die Vorhofflimmern umgestaltet (d. h., insbesondere für die ZFS1 Rattenmodell für MetS-bezogenen HFpEF)22zeigen. Bestehende Isolation Protokolle wurden optimiert und ergänzt durch eine einfache, maßgeschneiderte Gerät Intraluminal Druck der kardialen Hohlräume, führt zu höheren Erträgen von morphologisch und funktionell intakt Kardiomyozyten zu kontrollieren. Das folgende Protokoll sieht der Forscher eine schrittweise Anleitung, eine detaillierte Beschreibung der maßgeschneiderte Ausrüstung sowie eine Liste von Lösungen und eine umfassende Anleitung zur Fehlerbehebung.
Hier beschrieben wir zunächst ein Protokoll für die Isolierung von einzelligen asbesthaltiger aus einem Rattenmodell der MetS-bezogenen HFpEF, die zeigt Vorhofflimmern umgestaltet22markiert. Das Verfahren ist einzigartig anspruchsvoll, wie übermäßiges Fettgewebe die chirurgische Vorbereitung sowie die Kanülierung der Aorta, immer schwieriger machen kann. Die Anleitung zur Fehlerbehebung gemäß Tabelle 2 Adressen der am häufigsten auftretenden Probleme des Verfahrens isolie…
The authors have nothing to disclose.
Diese Forschung wurde unterstützt durch die DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung, d.b.), die EKFS (Else-Kröner-Fresenius-Stiftung, f.h.), und durch das BMBF (deutschen Bundesministerium für Bildung und Forschung) sowie Bosnien und Herzegowina-Charité, klinische Wissenschaftler Programm finanziert, von der Charité – Universitätsmedizin Berlin und das Berlin Institute of Health (f.h.).
ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
Styrofoam surface | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
Tubing | |||
LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |