وهنا يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل cardiomyocytes أذينية خلية واحدة من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على. دليل تنظيم الضغط إينترالومينال تجاويف القلب ينفذ تؤتي myocytes وظيفيا سليمة مناسبة للدراسات الإثارة-الانكماش-اقتران.
في هذه المقالة، يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل خلية واحدة أذينية cardiomyocytes (تابع) من نموذج الفئران من المتلازمة الأيضية (ميتس)-المتعلقة بفشل القلب مع كسر قذفي الحفاظ عليها (هفبيف). يتزايد انتشار ميتس المتصلة هفبيف، والقلب الرجفان المرتبطة بإعادة عرض الرجفان والرجفان الاذيني ذات الصلة سريرياً عاليا كما يعيد البناء الرجفان توقع مستقلة من الوفيات. كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. راريفيكيشن سفينة الدورة الدموية والتليف الخلالي الأنسجة تشكل عاملاً يحد يحتمل أن عزل الخلايا المفردة الناجحة تابع من نماذج حيوانية لهذا المرض.
ونحن قد تناول هذه المسألة باستخدام جهاز قادرة على تنظيم ضغط إينترالومينال تجاويف القلب يدوياً أثناء إجراء العزل، زيادة عائد تابع سليمة شكلياً ووظيفيا. يمكن استخدام خلايا المكتسبة في مجموعة متنوعة من تجارب مختلفة، مثل زراعة الخلايا وتصوير الكالسيوم وظيفية (أي، الإثارة-الانكماش-اقتران).
نحن تزويد الباحث ببروتوكول خطوة بخطوة، قائمة بالحلول الأمثل، وتعليمات شاملة لإعداد المعدات اللازمة، ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها شامل. حين التنفيذ الأولى للإجراء الذي قد يكون من الصعب بدلاً من ذلك، تسمح تكيف ناجح القارئ لأداء الدولة للفنون ACM العزلة في نموذج الفئران من هفبيف المتصلة ميتس لمجموعة واسعة من التجارب.
ميتس يصف مجموعة من عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين والسكري نوع-2 ويشمل ارتفاع ضغط الدم الشرياني، دسليبيدميا (آثار الشحوم وتخفيض الكوليسترول الكثافة lipoprotein)، زاد الصيام السكر، والسمنة المركزية1. انتشار ميتس في العالم يقدر بنسبة 25-30 في المائة، واستمرار ارتفاع2. هفبيف متلازمة سريرية ايربان غالباً ما ترتبط مع ميتس. إعادة عرض القلب أثناء هفبيف ومراحلها السابقة (أي، أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم) أيضا يرافق إعادة عرض اتريا3. انخفاض وظيفة الهوس والتغيرات الهيكلية الاذين الأيسر ارتبطت بزيادة معدل الوفيات والرجفان الاذيني وقصور القلب بداية جديدة4. إعادة عرض الرجفان يتسم بالتغيرات في وظيفة قناة أيون، Ca2 + التوازن، وهيكل أذينية والتنشيط تنتجها الخلايا الليفية، وأنسجة التليف5. غادر يعيد البناء الرجفان في ميتس المتصلة هفبيف والكامنة في الآليات المرضية التي لا تزال غير مفهومة وتحتاج إلى مزيد من التحقيقات متعمقة. وأثبتت نماذج حيوانية يكون أداة قيمة ويؤدي إلى العديد من التطورات في مجال القلب الرجفان6،7،،من89.
كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. عزلة، وثقافة الخلية اللاحقة المحتملة، تسمح للتحقيق مما يشير إلى مسارات والتيارات القناة الأيونية، والإثارة-الانكماش-اقتران. في ظل الظروف الفسيولوجية، لا تتكاثر كارديوميوسيتيس. الانصهار بين تسلسلات التنظيمية النسخي عامل atrial natriuretic وفيروس القردي 40 كبيرة تي مستضد في الفئران المعدلة وراثيا أدى إلى إنشاء تابع مخلدة الأولى، المسماة في-110. المزيد من تطوير خلايا تي-1 يثير الخلايا HL-1، التي لا يمكن إلا أن يكون باساجيد متسلسل ولكن أيضا العقد تلقائياً11. بيد أنهم، إظهار الاختلافات الهيكلية والوظيفية مقارنة مع الخلايا المعزولة حديثا، مثل أولتراستروكتوري أقل تنظيماً، حدوث ارتفاع النامية ميوفيبريلس11، و الحالية إلى الداخل12المنشط فرط الاستقطاب. يتم عزل cardiomyocytes البطين (VCM) في الجرذان والفئران من مجموعة متنوعة من نماذج راسخة13،،من1415،16،،من1718 , 19-عموما، هو قلب قصت المركبة بجهاز لانجيندورف وريتروجراديلي perfused مع Ca2 +-الحرة المخزن المؤقت الذي يحتوي على إنزيمات الجهاز الهضمي، مثل collagenases والبروتياز. الكالسيوم ثم مجددا على نحو تدريجي للظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، حتى ولو كانت البروتوكولات المخصصة لعزل تابع متاح20،21، بسبب زيادة التليف والخلافات المتعلقة بالضغوط، فائدتها في نماذج المرض مع إعادة عرض الرجفان محدودة.
في هذه المقالة، قمنا بتنفيذ بروتوكول لعزل أذينية cardiomyocytes خلية واحدة من الحيوانات التي تظهر الرجفان يعيد البناء (أي، وبخاصة لنموذج فأر ZFS1 هفبيف ذات الصلة ميتس)22. القائمة عزل البروتوكولات الأمثل ويكمله جهاز بسيطة، مصنوعة خصيصا لمراقبة وتعديل ضغط إينترالومينال تجاويف القلب، مما يؤدي إلى زيادة الغلات في cardiomyocytes سليمة شكلياً ووظيفيا. ويوفر البروتوكول التالي الباحث مع دليل خطوة بخطوة، ووصف مفصل لمعدات مصنوعة خصيصا، وقائمة بالحلول، فضلا عن دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
هنا، نحن أول من وصف بروتوكول لعزل تابع خلية واحدة من نموذج الفئران من المتصلة ميتس هفبيف تظهر علامة يعيد الرجفان22. الإجراء تحديا فريداً يمكن أن تجعل الأنسجة الدهنية المفرطة في إعداد العمليات الجراحية، فضلا عن كانولاتيون من الشريان الاورطي، تزداد صعوبة. وتقدم دليل استكشاف ال?…
The authors have nothing to disclose.
أيد هذا البحث دزهك (المركز الألماني “بحوث القلب والأوعية الدموية”، D.B.)، اكفس (Stiftung Else-كرنر-فريسينيوس، F.H.)، والألمانية (الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث)، فضلا عن البوسنة والهرسك-مستشفى الشارتي تمويل برنامج العلماء اﻻكلينيكي بمستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin ومعهد برلين للصحة (F.H.).
ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
Styrofoam surface | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
Tubing | |||
LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |