عزل كارديوميوسيتيس خوارج من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على
Summary
وهنا يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل cardiomyocytes أذينية خلية واحدة من نموذج الفئران من فشل القلب المتصلة بالمتلازمة الأيضية مع كسر قذفي الحفاظ على. دليل تنظيم الضغط إينترالومينال تجاويف القلب ينفذ تؤتي myocytes وظيفيا سليمة مناسبة للدراسات الإثارة-الانكماش-اقتران.
Abstract
في هذه المقالة، يصف لنا إجراء أمثل، على أساس لانجيندورف لعزل خلية واحدة أذينية cardiomyocytes (تابع) من نموذج الفئران من المتلازمة الأيضية (ميتس)-المتعلقة بفشل القلب مع كسر قذفي الحفاظ عليها (هفبيف). يتزايد انتشار ميتس المتصلة هفبيف، والقلب الرجفان المرتبطة بإعادة عرض الرجفان والرجفان الاذيني ذات الصلة سريرياً عاليا كما يعيد البناء الرجفان توقع مستقلة من الوفيات. كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. راريفيكيشن سفينة الدورة الدموية والتليف الخلالي الأنسجة تشكل عاملاً يحد يحتمل أن عزل الخلايا المفردة الناجحة تابع من نماذج حيوانية لهذا المرض.
ونحن قد تناول هذه المسألة باستخدام جهاز قادرة على تنظيم ضغط إينترالومينال تجاويف القلب يدوياً أثناء إجراء العزل، زيادة عائد تابع سليمة شكلياً ووظيفيا. يمكن استخدام خلايا المكتسبة في مجموعة متنوعة من تجارب مختلفة، مثل زراعة الخلايا وتصوير الكالسيوم وظيفية (أي، الإثارة-الانكماش-اقتران).
نحن تزويد الباحث ببروتوكول خطوة بخطوة، قائمة بالحلول الأمثل، وتعليمات شاملة لإعداد المعدات اللازمة، ودليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها شامل. حين التنفيذ الأولى للإجراء الذي قد يكون من الصعب بدلاً من ذلك، تسمح تكيف ناجح القارئ لأداء الدولة للفنون ACM العزلة في نموذج الفئران من هفبيف المتصلة ميتس لمجموعة واسعة من التجارب.
Introduction
ميتس يصف مجموعة من عوامل خطر الإصابة بأمراض القلب والشرايين والسكري نوع-2 ويشمل ارتفاع ضغط الدم الشرياني، دسليبيدميا (آثار الشحوم وتخفيض الكوليسترول الكثافة lipoprotein)، زاد الصيام السكر، والسمنة المركزية1. انتشار ميتس في العالم يقدر بنسبة 25-30 في المائة، واستمرار ارتفاع2. هفبيف متلازمة سريرية ايربان غالباً ما ترتبط مع ميتس. إعادة عرض القلب أثناء هفبيف ومراحلها السابقة (أي، أمراض القلب ارتفاع ضغط الدم) أيضا يرافق إعادة عرض اتريا3. انخفاض وظيفة الهوس والتغيرات الهيكلية الاذين الأيسر ارتبطت بزيادة معدل الوفيات والرجفان الاذيني وقصور القلب بداية جديدة4. إعادة عرض الرجفان يتسم بالتغيرات في وظيفة قناة أيون، Ca2 + التوازن، وهيكل أذينية والتنشيط تنتجها الخلايا الليفية، وأنسجة التليف5. غادر يعيد البناء الرجفان في ميتس المتصلة هفبيف والكامنة في الآليات المرضية التي لا تزال غير مفهومة وتحتاج إلى مزيد من التحقيقات متعمقة. وأثبتت نماذج حيوانية يكون أداة قيمة ويؤدي إلى العديد من التطورات في مجال القلب الرجفان6،7،،من89.
كثيرا ما تستخدم الدراسات مع عزل الخلايا المفردة كارديوميوسيتيس التثبت وتكمل في فيفو النتائج التي توصل إليها. عزلة، وثقافة الخلية اللاحقة المحتملة، تسمح للتحقيق مما يشير إلى مسارات والتيارات القناة الأيونية، والإثارة-الانكماش-اقتران. في ظل الظروف الفسيولوجية، لا تتكاثر كارديوميوسيتيس. الانصهار بين تسلسلات التنظيمية النسخي عامل atrial natriuretic وفيروس القردي 40 كبيرة تي مستضد في الفئران المعدلة وراثيا أدى إلى إنشاء تابع مخلدة الأولى، المسماة في-110. المزيد من تطوير خلايا تي-1 يثير الخلايا HL-1، التي لا يمكن إلا أن يكون باساجيد متسلسل ولكن أيضا العقد تلقائياً11. بيد أنهم، إظهار الاختلافات الهيكلية والوظيفية مقارنة مع الخلايا المعزولة حديثا، مثل أولتراستروكتوري أقل تنظيماً، حدوث ارتفاع النامية ميوفيبريلس11، و الحالية إلى الداخل12المنشط فرط الاستقطاب. يتم عزل cardiomyocytes البطين (VCM) في الجرذان والفئران من مجموعة متنوعة من نماذج راسخة13،،من1415،16،،من1718 , 19-عموما، هو قلب قصت المركبة بجهاز لانجيندورف وريتروجراديلي perfused مع Ca2 +-الحرة المخزن المؤقت الذي يحتوي على إنزيمات الجهاز الهضمي، مثل collagenases والبروتياز. الكالسيوم ثم مجددا على نحو تدريجي للظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، حتى ولو كانت البروتوكولات المخصصة لعزل تابع متاح20،21، بسبب زيادة التليف والخلافات المتعلقة بالضغوط، فائدتها في نماذج المرض مع إعادة عرض الرجفان محدودة.
في هذه المقالة، قمنا بتنفيذ بروتوكول لعزل أذينية cardiomyocytes خلية واحدة من الحيوانات التي تظهر الرجفان يعيد البناء (أي، وبخاصة لنموذج فأر ZFS1 هفبيف ذات الصلة ميتس)22. القائمة عزل البروتوكولات الأمثل ويكمله جهاز بسيطة، مصنوعة خصيصا لمراقبة وتعديل ضغط إينترالومينال تجاويف القلب، مما يؤدي إلى زيادة الغلات في cardiomyocytes سليمة شكلياً ووظيفيا. ويوفر البروتوكول التالي الباحث مع دليل خطوة بخطوة، ووصف مفصل لمعدات مصنوعة خصيصا، وقائمة بالحلول، فضلا عن دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نحن أول من وصف بروتوكول لعزل تابع خلية واحدة من نموذج الفئران من المتصلة ميتس هفبيف تظهر علامة يعيد الرجفان22. الإجراء تحديا فريداً يمكن أن تجعل الأنسجة الدهنية المفرطة في إعداد العمليات الجراحية، فضلا عن كانولاتيون من الشريان الاورطي، تزداد صعوبة. وتقدم دليل استكشاف ال?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا البحث دزهك (المركز الألماني “بحوث القلب والأوعية الدموية”، D.B.)، اكفس (Stiftung Else-كرنر-فريسينيوس، F.H.)، والألمانية (الوزارة الألمانية للتعليم والبحوث)، فضلا عن البوسنة والهرسك-مستشفى الشارتي تمويل برنامج العلماء اﻻكلينيكي بمستشفى الشارتي-برلين Universitätsmedizin ومعهد برلين للصحة (F.H.).
Materials
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
Referências
- Alberti, K. G., et al. Harmonizing the metabolic syndrome: a joint interim statement of the International Diabetes Federation Task Force on Epidemiology and Prevention; National Heart, Lung, and Blood Institute; American Heart Association; World Heart Federation; International Atherosclerosis Society; and International Association for the Study of Obesity. Circulation. 120 (16), 1640-1645 (2009).
- . IDF Consensus Worldwide Definition of the Metabolic Syndrome Available from: https://www.idf.org/e-library/consensus-statements/60-idfconsensus-worldwide-definitionof-the-metabolic-syndrome.html (2006)
- Melenovsky, V., et al. Left atrial remodeling and function in advanced heart failure with preserved or reduced ejection fraction. Circulation: Heart Failure. 8 (2), 295-303 (2015).
- Goette, A., et al. EHRA/HRS/APHRS/SOLAECE expert consensus on atrial cardiomyopathies: definition, characterization, and clinical implication. EP Europace. 18 (10), 1455-1490 (2016).
- Schotten, U., Verheule, S., Kirchhof, P., Goette, A. Pathophysiological mechanisms of atrial fibrillation: a translational appraisal. Physiological Reviews. 91 (1), 265-325 (2011).
- Hohendanner, F., DeSantiago, J., Heinzel, F. R., Blatter, L. A. Dyssynchronous calcium removal in heart failure-induced atrial remodeling. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 311 (6), H1352-H1359 (2016).
- Hohendanner, F., et al. Inositol-1,4,5-trisphosphate induced Ca2+ release and excitation-contraction coupling in atrial myocytes from normal and failing hearts. The Journal of Physiology. 593 (6), 1459-1477 (2015).
- Tada, Y., et al. Role of mineralocorticoid receptor on experimental cerebral aneurysms in rats. Hypertension. 54 (3), 552-557 (2009).
- Iwasaki, Y. K., et al. Atrial fibrillation promotion with long-term repetitive obstructive sleep apnea in a rat model. Journal of the American College of Cardiology. 64 (19), 2013-2023 (2014).
- Field, L. J. Atrial natriuretic factor-SV40 T antigen transgenes produce tumors and cardiac arrhythmias in mice. Science. 239 (4843), 1029-1033 (1988).
- Claycomb, W. C., et al. HL-1 cells: a cardiac muscle cell line that contracts and retains phenotypic characteristics of the adult cardiomyocyte. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (6), 2979-2984 (1998).
- Sartiani, L., Bochet, P., Cerbai, E., Mugelli, A., Fischmeister, R. Functional expression of the hyperpolarization-activated, non-selective cation current I(f) in immortalized HL-1 cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 545 (Pt 1), 81-92 (2002).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).
- Gunduz, D., Hamm, C. W., Aslam, M. Simultaneous Isolation of High Quality Cardiomyocytes, Endothelial Cells, and Fibroblasts from an Adult Rat Heart. Journal of Visualized Experiments. (123), e55601 (2017).
- Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. Journal of Visualized Experiments. (87), e51357 (2014).
- Graham, E. L., et al. Isolation, culture, and functional characterization of adult mouse cardiomyoctyes. Journal of Visualized Experiments. (79), e50289 (2013).
- Roth, G. M., Bader, D. M., Pfaltzgraff, E. R. Isolation and physiological analysis of mouse cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (91), e51109 (2014).
- Thum, T., Borlak, J. Isolation and cultivation of Ca2+ tolerant cardiomyocytes from the adult rat: improvements and applications. Xenobiotica. 30 (11), 1063-1077 (2000).
- Egorova, M. V., Afanas’ev, S. A., Popov, S. V. A simple method for isolation of cardiomyocytes from adult rat heart. Bulletin of Experimental Biology and Medicine. 140 (3), 370-373 (2005).
- Kohncke, C., et al. Isolation and Kv channel recordings in murine atrial and ventricular cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e50145 (2013).
- Wagner, E., Brandenburg, S., Kohl, T., Lehnart, S. E. Analysis of tubular membrane networks in cardiac myocytes from atria and ventricles. Journal of Visualized Experiments. (92), e51823 (2014).
- Hohendanner, F., et al. Cellular mechanisms of metabolic syndrome-related atrial decompensation in a rat model of HFpEF. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 115, 10-19 (2017).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments. (44), e2033 (2010).
- Bootman, M. D., Higazi, D. R., Coombes, S., Roderick, H. L. Calcium signalling during excitation-contraction coupling in mammalian atrial myocytes. Journal of Cell Science. 119 (Pt 19), 3915-3925 (2006).
- Smyrnias, I., et al. Comparison of the T-tubule system in adult rat ventricular and atrial myocytes, and its role in excitation-contraction coupling and inotropic stimulation. Cell Calcium. 47 (3), 210-223 (2010).
- Pritchett, A. M., et al. Diastolic dysfunction and left atrial volume: a population-based study. Journal of the American College of Cardiology. 45 (1), 87-92 (2005).
- Linz, D., et al. Cathepsin A mediates susceptibility to atrial tachyarrhythmia and impairment of atrial emptying function in Zucker diabetic fatty rats. Cardiovascular Research. 110 (3), 371-380 (2016).
- Ackers-Johnson, M., et al. A Simplified, Langendorff-Free Method for Concomitant Isolation of Viable Cardiac Myocytes and Nonmyocytes From the Adult Mouse Heart. Circulation Research. 119 (8), 909-920 (2016).
- Ramanathan, T., Skinner, H. Coronary blood flow. Continuing Education in Anaesthesia Critical Care & Pain. 5 (2), 61-64 (2005).
- Bond, M. D., Van Wart, H. E. Characterization of the individual collagenases from Clostridium histolyticum. Bioquímica. 23 (13), 3085-3091 (1984).
- Deel, E. D., et al. In vitro model to study the effects of matrix stiffening on Ca(2+) handling and myofilament function in isolated adult rat cardiomyocytes. The Journal of Physiology. 595 (14), 4597-4610 (2017).
- Wuensch, E., Heidrich, H. G. [On the Quantitative Determination of Collagenase]. Hoppe-Seyler’s Zeitschrift für physiologische Chemie. 333, 149-151 (1963).
- Conceicao, G., Heinonen, I., Lourenco, A. P., Duncker, D. J., Falcao-Pires, I. Animal models of heart failure with preserved ejection fraction. Netherlands Heart Journal. 24 (4), 275-286 (2016).
- Horgan, S., Watson, C., Glezeva, N., Baugh, J. Murine models of diastolic dysfunction and heart failure with preserved ejection fraction. Journal of Cardiac Failure. 20 (12), 984-995 (2014).
