Analisi trascrittomica unicellulare delle cellule Endocrine del pancreas del Mouse
Summary
Descriviamo un metodo per l’isolamento di cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale, seguite dal sequenziamento di RNA di cella singola. Questo metodo consente analisi dello sviluppo del pancreas endocrino lignaggio, eterogeneità e trascrittomica dinamiche di cella.
Abstract
Le cellule endocrine del pancreas, che sono raggruppate in isolotti, regolano la stabilità di glucosio nel sangue e il metabolismo energetico. I tipi distinti delle cellule in isolotti, tra cui insulina-secrezione delle cellule β, sono differenziati da progenitori endocrini comuni durante la fase embrionale. Le cellule endocrine immature espandere tramite proliferazione delle cellule e maturare durante un periodo di sviluppo lungo postnatale. Tuttavia, i meccanismi alla base di questi processi non sono chiaramente definiti. Cella singola RNA-sequenziamento è un approccio promettente per la caratterizzazione di popolazioni distinte delle cellule e l’analisi delle cellule lignaggio differenziazione pathways. Qui, descriviamo un metodo per il cella singola RNA-sequenziamento delle cellule β del pancreas isolato dal pancreas embrionale, neonatale e postnatale.
Introduction
Il pancreas è un organo metabolico vitale nei mammiferi. Il pancreas è costituito da scomparti endocrini ed esocrini. Le cellule endocrine del pancreas, tra cui cellule β che producono insulina e glucagone-producendo le cellule α, raggruppare in cluster degli isolotti di Langerhans e coordinatamente regolano l’omeostasi del glucosio sistemico. Disfunzione delle cellule endocrine si traduce in diabete mellito, che è diventato un problema importante di sanità pubblica in tutto il mondo.
Le cellule endocrine del pancreas sono derivate da Ngn3+ progenitori durante l’embriogenesi1. Più tardi, durante il periodo perinatale, le cellule endocrine proliferano negli isolotti immaturo di forma. Queste cellule immature continuano a sviluppare e gradualmente diventare maturi isolotti, che riccamente vascolarizzati per regolare l’omeostasi del glucosio di anima in adulti2.
Anche se è stato identificato un gruppo di fattori trascrizionali che regolano la differenziazione delle cellule β, la via precisa maturazione delle cellule β è ancora poco chiara. Inoltre, il processo di maturazione delle cellule β coinvolge anche il regolamento di cella numero espansione3,4 e la generazione di eterogeneità cellulare5,6. Tuttavia, i meccanismi di regolamentazione di questi processi non sono stati studiati bene.
Cella singola RNA-sequenziamento è un approccio potente che può profile sottopopolazioni delle cellule e traccia cella lignaggio vie dello sviluppo7. Approfittando di questa tecnologia, la chiave di eventi che si verificano durante lo sviluppo dell’isolotto pancreatico possono essere decifrati al livello unicellulare8. Tra i protocolli di RNA-sequenziamento unicellulare, Smart-seq2 consente la generazione di cDNA integrale con una migliore sensibilità e precisione e l’uso di reagenti normalizzati a più basso costo9. Smart-seq2 richiede circa due giorni per costruire una libreria di cDNA per sequenziamento10.
Qui, vi proponiamo un metodo per l’isolamento delle cellule β fluorescenza-etichettati dal pancreas del feto per adulto Ins1-RFP topi transgenici11, usando la fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS), e le prestazioni di trascrittomica analizza presso il livello di singola cellula, utilizzando la tecnologia Smart-seq2 (Figura 1). Questo protocollo può essere esteso per analizzare i trascrittomi di tutti i tipi di cellula endocrina pancreatica negli stati normali, patologici e invecchiamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo protocollo, abbiamo dimostrato un metodo efficace e facile da usare per studiare i profili di espressione di singole cellule delle cellule β del pancreas. Questo metodo potrebbe essere utilizzato per isolare le cellule endocrine da pancreas embrionale, neonatale e postnatale e per eseguire analisi trascrittomica unicellulare.
Il punto più critico è l’isolamento di cellule β singolo in buone condizioni. Pancreas completamente irrorato rispondono meglio alla successiva digestione. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il centro nazionale per Protein Sciences, Beijing (Peking University) e il centro di Tsinghua di Pechino per la piattaforma di Computing di Life Science. Questo lavoro è stato supportato dal Ministero della scienza e tecnologia della Cina (2015CB942800), National Foundation Natural Science of China (31521004, 31471358 e 31522036) e finanziamenti da Tsinghua di Pechino centro per le scienze della vita a C.-chrysantha
Materials
| Collagenase P | Roche | 11213873001 | |
| Trypsin-EDTA (0.25 %), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 25200114 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30071.03 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz | RS-4904 | |
| Dumont #5 Forceps | Roboz | RS-5058 | |
| 30 G BD Needle 1/2" Length | BD | 305106 | |
| Stereo Microscope | Zeiss | Stemi DV4 | |
| Stereo Fluorescence microscope | Zeiss | Stereo Lumar V12 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424R | |
| Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | BD-Falcon | 352235 | |
| 96-Well PCR Microplate | Axygen | PCR-96-C | |
| Silicone Sealing Mat | Axygen | AM-96-PCR-RD | |
| Thin Well PCR Tube | Extragene | P-02X8-CF | |
| Cell sorter | BD Biosciences | BD FACSAria | |
| Capillary pipette | Sutter | B100-58-10 | |
| RNaseZap | Ambion | AM9780 | |
| ERCC RNA Spike-In Mix | Life Technologies | 4456740 | |
| Distilled water | Gibco | 10977 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| dNTP mix | New England Biolabs | N0447 | |
| Recombinant RNase Inhibitor | Takara | 2313 | |
| Superscript II reverse transcriptase | Invitrogen | 18064-014 | |
| First-strand buffer (5x) | Invitrogen | 18064-014 | |
| DTT | Invitrogen | 18064-014 | |
| Betaine | Sigma-Aldrich | 107-43-7 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Nuclease-free water | Invitrogen | AM9932 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2x) | KAPA Biosystems | KK2601 | |
| VAHTS DNA Clean Beads XP beads | Vazyme | N411-03 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | Q32854 | |
| AceQ qPCR SYBR Green Master Mix | Vazyme | Q121-02 | |
| TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina | Vazyme | TD502 | Include 5x TTBL, 5x TTE, 5x TS, 5x TAB, TAE |
| TruePrep Index Kit V3 for Illumina | Vazyme | TD203 | Include 16 N6XX and 24 N8XX |
| High Sensitivity NGS Fragment Analysis Kit | Advanced Analytical Technologies | DNF-474 | |
| 1x HBSS without Ca2+ and Mg2+ | 138 mM NaCl; 5.34 mM KCl 4.17 mM NaHCO3; 0.34 mM Na2HPO4 0.44 mM KH2PO4 |
||
| Isolation buffer | 1 × HBSS containing 10 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 5 mM Glucose, pH 7.4 | ||
| FACS buffer | 1 × HBSS containing 15 mM HEPES, 5.6 mM Glucose, 1% FBS, pH 7.4 | ||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S6297 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S5136 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Oligo-dT30VN primer | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3' | ||
| TSO | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G-3' | ||
| ISPCR primers | 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3' | ||
| Gapdh Forward primer | 5'-ATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3' | ||
| Gapdh Reverse primer | 5'-GCCTTGACTGTGCCGTTGAAT-3' | ||
| Ins2 Forward primer | 5'-TGGCTTCTTCTACACACCCA-3' | ||
| Ins2 Reverse primer | 5'-TCTAGTTGCAGTAGTTCTCCA-3' |
Referências
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