Полнометражный отдельных proviral последовательности (ЗЕРКАЛЬНО) предоставляет эффективный и высокопроизводительный метод для амплификации и последовательности Single, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных) proviruses ВИЧ-1 и позволяет для определения их потенциальных возможностей Репликация компетенции. САЛЬТО преодолевает ограничения предыдущих анализов, предназначенных для последовательности латентной водохранилище ВИЧ-1.
Assay полноразмерные отдельных Proviral виртуализации (ЗЕРКАЛЬНО) является эффективной и высок объём метод, предназначенный для усиления и последовательности сингл, вблизи полнометражный (нетронутыми и дефектных), ВИЧ-1 proviruses. ОТРАЖЕНИЕ позволяет определять генетический состав интегрированных ВИЧ-1 в популяции клеток. Путем выявления дефектов в течение ВИЧ-1 proviral последовательности, которые возникают во время обратной транскрипции, например больших внутренних исключений, пагубные стоп-кодонов/Гипермутационный, фреймшифт мутации и мутации/удалений в СНГ выступающих элементов требуется для созревания вириона сальто можно определить комплексный proviruses состоянии репликации. САЛЬТО assay может использоваться для определения ВИЧ-1 proviruses, которые не имеют эти дефекты и поэтому потенциально репликации компетентным. САЛЬТО протокол включает в себя: lysis клеток инфицированных ВИЧ-1, вложенные PCR вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses (с помощью грунтовки, ориентированные на ВИЧ-1 5′ и 3′ LTR), Очищение дна и количественной оценки, подготовки для виртуализации нового поколения (НГС), NGS, Библиотека de novo Ассамблеи proviral Сахалинской и простой процесс ликвидации для выявления репликации компетентных proviruses. ОТРАЖЕНИЕ предоставляет преимущества над традиционными методами, предназначенных для последовательности интеграции ВИЧ-1 proviruses, таких как сингл proviral последовательности. САЛЬТО усиливает и последовательностей вблизи полнометражные proviruses включение репликации компетентности должен определяться, а также использует меньше амплификации грунтовки, предотвратить последствия несоответствия грунт. ОТРАЖЕНИЕ является полезным инструментом для понимания генетических пейзаж комплексной proviruses ВИЧ-1, особенно в рамках скрытой водохранилище, однако ее использование может распространяться на любое приложение, в котором требуется генетический состав интегрированных ВИЧ-1.
Генетическая характеристика латентной водохранилища ВИЧ-1, который упорно лиц на долгосрочной антиретровирусной терапии (АРТ), был жизненно важное значение для понимания, что большинство комплексной proviruses являются дефектные и репликации некомпетентность1 , 2. в процессе обратной транскрипции, ошибки вводятся в комплексной proviral последовательность. Некоторые механизмы, которые генерируют дефектных proviral последовательности включают ошибкам-фермента обратной транскриптазы ВИЧ-13, шаблон, Переключение4, и/или APOBEC-индуцированной Гипермутационный5,6. Два недавних исследования обнаружил, что примерно 5% ВИЧ-1 proviruses, изолированные от физических лиц на долгосрочной искусства являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентным и может способствовать быстрому отскок в плазме крови ВИЧ-1 при прекращении искусства 1 , 2 , 7. предыдущие исследования выявили, что компетентные репликации ВИЧ-1 proviruses сохраняются в наивной и отдыха памяти CD4+ T клетки подмножеств (включая центральные, переходных и эффекторные клетки памяти T), указывая значение ориентация этих клеток в будущем искоренения стратегии2,8,9.
Ранние идеи в распределение, динамика и поддержание латентной водохранилища ВИЧ-1 были достигнуты за счет использования методов секвенирования сингл proviral (СФМ), генетически характеризуют суб геномных областей генома ВИЧ-110 ,11,12,13. SPS-это универсальный инструмент, состоянии последовательности одного Провирус ВИЧ-1 от в пределах одной инфицированной клетки. Однако СПС не может определить компетенцию репликации proviruses, поскольку он только последовательности суб геномных регионов и промахи proviruses, которые содержат большие изъятия в рамках сайтов связывания праймера. Предыдущие исследования продемонстрировал SPS завышает размер репликации компетентных водохранилище на 13 – 17 раз через избирательно секвенирования нетронутыми суб геномных регионов2.
Для устранения ограничений SPS, Хо и др. 4 и Брунер и др. 1 разработан анализов последовательности вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Это позволило частота генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1 в отдельных лиц на долгосрочной искусства будут определены. Эти анализы усиливается и виртуализации (через Сэнгер секвенирования) суб геномных регионов, которые затем были собраны для получения последовательности (нетронутыми или дефектных) Провирус ВИЧ-1. Три ограничения такого подхода являются: 1) использование нескольких последовательности грунтовки увеличивает риск непреднамеренного включения дефекты в proviral последовательности, 2) грунт несоответствия могут предотвратить усиление конкретных proviruses и 3) часто Вся proviral последовательность не может быть разрешен за счет формальность этих методов.
Чтобы преодолеть ограничения существующих полнометражного анализов proviral Секвенирование ВИЧ-1, мы разработали Full –Лength яндивидуальное Pантиретровирусные Sequencing (ЗЕРКАЛЬНО) assay. ОТРАЖЕНИЕ является секвенирование нового поколения (НГС)-на основе анализа, который усиливает и последовательностей вблизи полнометражный (нетронутыми или дефектных) ВИЧ-1 proviruses высокой пропускной способности и эффективным образом. САЛЬТО обеспечивает преимущества по сравнению с предыдущим анализов, как она ограничивает количество грунтовки использовать; Таким образом это снижает вероятность грунтовка несоответствия, которые могут ограничить численность населения proviruses захватили или непреднамеренно ввести дефекты в Вирусный последовательность. ОТРАЖЕНИЕ является также менее технически сложной, чем предыдущие анализы и включает 6 основных этапов: клетки 1) вызывает лизис инфицированных ВИЧ-1, 2) усиление одного ВИЧ-1 proviruses через вложенные ПЦР на ограничение разрежения с помощью грунтовки, специфичных для высоко сохранены HIV-1 5′ и 3′ U5 LTR региона (рис. 1а), 3) очистки и количественная оценка усиливается продукции, 4) подготовка библиотека усиливается proviruses NGS, 5) NGS и 6) de novo Ассамблея виртуализированного proviruses для получения Сахалинской каждого Индивидуальные Провирус.
Последовательности, генерируемые сальто может пройти строгий процесс ликвидации определить те из них, которые являются генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентных (рис. 1 c)2. Генетически нетронутыми proviruses отсутствие все известные дефекты, которые привести поколения Провирус репликации некомпетентность. Эти недостатки включают в себя: инверсии последовательностей, большой внутренней удалений, Гипермутационный/пагубное стоп-кодонов, frameshifts или мутации в 5′ упаковка сигнала или крупных сращивания донора (MSD) сайта.
Рисунок 1: важнейшие шаги в assay полнометражных последовательности отдельных proviral (ЗЕРКАЛЬНО). (A) ВИЧ-1 ДНК генома с сайтов связывания праймера в 5′ и 3′ регионах U5 LTR используется сальто для того чтобы усилить вблизи полнометражный (дефектных и нетронутыми) ВИЧ-1 proviruses через вложенные PCR. (B) макет 96-луночных ПЦР пластины, содержащих 80 образца скважин (20 скважин для каждого разведения), 4 отрицательный контроль скважины и 1 положительный контроль хорошо. (C) процесс ликвидации, используемый для идентификации генетически нетронутыми и потенциально репликации компетентный, proviruses ВИЧ-1. Этот показатель был изменен с Hiener и др. 2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Assay сальто является эффективным и высок объём метод для усиления и секвенирования сингл, вблизи полнометражные proviruses ВИЧ-1. Было выявлено несколько факторов и важные шаги в протоколе, которые влияют на количество и качество полученной последовательности. Во-первых количество клеток и частота ВИЧ-1 инфекции популяции клеток влияет на количество proviruses усиливается. Например, в предыдущей публикации, примерно половина столько последовательностей были получены от такое же количество наивно CD4+ T по сравнению с эффекторных памяти CD4 клеток+ T клетки. Это потому, что наивно клетки, как правило, имеют более низкой частоте инфекции, чем память эффекторные клетки2. Во-вторых лизис клеток является предпочтительным для методов на основе столбца извлечения для получения геномной ДНК, как нет никакого риска потерять ДНК в процессе извлечения. И наконец как и в случае с любой на основе ПЦР анализа, предотвращая загрязнение имеет решающее значение. Раздельный чистых районов должны быть назначены для подготовки мастер смеси, обработка геномной ДНК, добавив позитивные элементы, Очищение дна и количественная оценка и подготовка библиотеки. Это особенно важно для анализов одной копии таких представленных здесь.
Осуществление анализа сальто следует сначала включают запуск положительный контроль таких плазмид pNL4-3, вместо того, чтобы участник образцы. Это позволит для любых неполадок до их использования позитивных клеток ВИЧ-1, как полученные последовательности можно сравнить с последовательности доступны ссылки для этих плазмидов. При использовании положительных клеток ВИЧ-1, важно рассматривать ВИЧ 1 подтип (грунты, предназначенные для сальто являются специфическими для подтипа B) и частота инфицирования популяции клеток, если мало не proviruses усиливаются. Грунтовка последовательности может быть изменен/переработаны, чтобы соответствовать другие подтипы. Кроме того также содержащий положительный контроль должны быть включены в каждую ПЦР выполнена.
САЛЬТО преодолеть ограничения предыдущих анализов виртуализации, включая SPS. Путем усиления и последовательности вблизи полнометражного ВИЧ-1 proviruses сальто можно определить потенциальных профессиональных качеств репликации ВИЧ-1 proviruses. Это не было возможно с помощью SPS, который виртуализировать только суб геномных регионов и поэтому выбрали для последовательностей с сайтов связывания primer нетронутыми. Кроме того сальто преодолевает ограничения, связанные с использованием нескольких амплификации и секвенирования грунтовки, как был нанят полнометражных последовательности предыдущих анализов1,4. Через два раунда ПЦР, ориентация в регионах ВИЧ-1 л, в сочетании с NGS сальто уменьшает количество и сложность требует грунтовки. Таким образом, сальто менее подвержен последствия несоответствия грунт, а именно ошибочной идентификации дефектных proviruses и неспособность некоторых proviruses в пределах населения усиливаются. САЛЬТО протокол является также более эффективным и позволяет более высокую пропускную способность по виртуализации чем предыдущие методы.
Очевидно сальто обеспечивает преимущества по сравнению с существующими методами, которые определяют генетический состав ВИЧ-1 proviruses. Однако важно признать ограничения сальто. Во-первых пробирного сальто не разработан как инструмент для измерения размеров скрытых водохранилища ВИЧ-1, как анализы, чтобы определить, является ли сальто усиливает каждый Провирус ВИЧ-1 в популяции клеток еще не завершены. САЛЬТО вместо полезен для относительного сравнения состава водохранилища между различных клеточных популяций2. Во-вторых компетенцию репликации нетронутыми ВИЧ-1 proviruses не может быть определен с точностью без в vivo исследований, таких как выполняемых Хо et al. 4. в-третьих, сальто не предназначен для определения сайта интеграции ВИЧ-1 proviruses.
Незначительные изменения в протоколе сальто может увеличить его применения. Например изменения в грунт, что последовательности можно разрешить различные и несколько подтипов ВИЧ-1 усиливается и виртуализации. Секвенирование вирионов плазмы ВИЧ-1 возможна путем добавления синтеза cDNA до вложенных PCR. Будущего использования методов секвенирования одной молекулы позволит устранить потребность в de novo Ассамблеи.
Генетическое секвенирование комплексной ВИЧ-1 proviruses возросло наше понимание скрытых водохранилища ВИЧ-1. ОТРАЖЕНИЕ является важным инструментом для будущих исследований, изучение состава и распределения латентной водохранилища. Однако применение сальто может выходить за рамки водохранилище. Будущие исследования может использовать отражение для определения конкретных целей для технологии ТРИФОСФАТЫ-Cas, или помочь в идентификации кодирования и некодирующих регионов, которые делают вирус быстрее реагировать на задержку, вспять агентов. Вирусная Рекомбинация может пониматься лучше, глядя на стыке сайты крупных внутренних исключений.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана Делани предприятие исследования СПИДа (DARE) чтобы найти лекарство (1U19AI096109 и 1UM1AI126611-01); amfAR исследовательский консорциум на искоренение ВИЧ (ARCHE) совместный исследовательский грант от фонда для исследований в области СПИДа (АМФАР 108074-50-RGRL); Австралийский центр по ВИЧ и гепатит вирусологии исследований (ACH2); UCSF-ГИВИ центр исследований СПИДа (P30 AI027763); и австралийского национального здравоохранения и медицинских исследований Совета (AAP1061681). Мы хотели бы поблагодарить д-р Joey лай, менеджер фонда геномики в Westmead институте медицинских исследований для его подготовки в библиотеке подготовки и использования его объекта и Ramaciotti Центр геномики (Университет Нового Южного Уэльса, Сидней, Австралия) для проведения последовательности. Мы с благодарностью признаем участников, кто пожертвовал образцы для этого исследования.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |