كامل طول التسلسل بروفيرال الفردية (تقلب) يوفر طريقة فعالة والفائق للتضخيم وتسلسل واحد، قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة ومعيبة) ويسمح لتحديد قدراتهم النسخ المتماثل-الكفاءات. تقلب ويتغلب على القيود المفروضة على الاختبارات السابقة الرامية إلى تسلسل الخزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة.
فحص كامل المدة الفردية بروفيرال التسلسل (تقلب) أسلوب كفاءة والفائق تهدف إلى تضخيم وتسلسل واحد، قرب بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة ومعيبة)، كامل طول. تقلب يسمح تحديد التركيب الجيني المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 ضمن عدد سكان خلية. من خلال تحديد العيوب ضمن تسلسل بروفيرال فيروس نقص المناعة البشرية-1 التي تنشأ أثناء النسخ العكسي، مثل الحذف الداخلية الكبيرة، توقف ضارة codons/هايبرموتيشن والطفرات فراميشيفت والطفرات/الحذف في رابطة الدول المستقلة بالعناصر المطلوبة لانضاج virion، يمكن تحديد تقلب بروفيروسيس متكامل قادر على النسخ المتماثل. يمكن أن تستخدم مقايسة تقلب التعرف على فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس التي تفتقر إلى هذه العيوب ومن ثم يحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل. ينطوي البروتوكول تقلب: تحلل خلايا المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1، متداخلة بكر من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس (استخدام كبسولة تفجير يستهدف 5 فيروس نقص المناعة البشرية-1 ‘و 3’ لتر)، تنقية الحمض النووي، والتقدير الكمي، إعداد المكتبة للجيل التالي التسلسل (خ ع)، خ ع، الجمعية دي نوفو كونتيجس بروفيرال، وعملية بسيطة للقضاء لتحديد بروفيروسيس النسخ المتماثل المختصة. تقلب يوفر مزايا أكثر من الأساليب التقليدية مصممة لتسلسل المتكاملة بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1، مثل تسلسل واحد بروفيرال. تقلب يسهب وتسلسل قرب بروفيروسيس كامل طول تمكين الكفاءات النسخ المتماثل يتم تحديد، ويستخدم أيضا أقل التضخيم الإشعال، منع عواقب عدم التطابق التمهيدي. تقلب أداة مفيدة لفهم المشهد الوراثية من بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 المتكاملة، لا سيما داخل الخزان الكامنة، ومع ذلك، يمكنك توسيع الانتفاع بها لأي تطبيق مطلوب التركيب الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية-1 المتكاملة التي.
التوصيف الوراثي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 الخزان الكامنة، التي استمرت في الأفراد على المدى الطويل العلاج المضاد للفيروسات (الفن)، كانت حيوية لفهم أن أغلبية بروفيروسيس المتكاملة هي معيبة وغير كفء النسخ المتماثل1 , 2-خلال عملية النسخ العكسي، يتم عرض الأخطاء ضمن تسلسل بروفيرال المتكاملة. وتشمل بعض آليات توليد متواليات بروفيرال المعيبة عرضه للخطأ إنزيم المنتسخة العكسية فيروس نقص المناعة البشرية-13، القالب التبديل بين4و/أو5،هايبرموتيشن التي يسببها أبوبيك6. وقد وجدت الدراسات الأخيرة اثنين أن حوالي 5 في المائة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس المعزولة من الأفراد على المدى الطويل الفن سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل، وقد تساهم في انتعاش سريع في مستويات البلازما فيروس نقص المناعة البشرية-1 عند وقف أعمال الفن 1 , 2 , 7-وحددت الدراسات السابقة أن بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 النسخ المتماثل المختصة مستمرة في السذاجة ويستريح الذاكرة CD4+ تي الخلية مجموعات فرعية (بما في ذلك خلايا الذاكرة تي المستجيب والمركزية والانتقالية)، مما يشير إلى الأهمية استهداف هذه الخلايا في المستقبل القضاء على استراتيجيات2،،من89.
وتحققت أوائل ثاقبة التوزيع، وديناميات وصيانة خزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة من خلال استخدام أساليب تسلسل واحد بروفيرال (SPS) التي تميز المناطق الفرعية الجينوم جينوم فيروس نقص المناعة البشرية-110 وراثيا ،11،،من1213. الصحة والصحة النباتية أداة مرنة، قادرة على تسلسل بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 واحد من داخل خلية مصابة واحدة. الصحة والصحة النباتية غير قادر على تحديد النسخ المتماثل-الكفاءات بروفيروسيس، حيث أنها تتابع فقط بروفيروسيس المناطق ويفتقد الجينومية الفرعية التي تحتوي على عمليات الحذف كبيرة داخل مواقع الربط التمهيدي. دراسة سابقة أظهرت أن الحزب الاشتراكي يغالي حجم الخزان النسخ المتماثل المختصة ب 13-إلى 17-أمثال من خلال تسلسل المناطق الفرعية الجينوم سليمة2بشكل انتقائي.
لمعالجة أوجه القصور في الصحة والصحة النباتية، هو وآخرون 4 وبرونر et al. 1 طور معبراً لتسلسل قرب كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. هذا يسمح بتواتر بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون النسخ المتماثل-المختصة، في الأفراد على المدى الطويل الفن يتحدد. تفصيل هذه الاختبارات والتسلسل (عبر سانغر التسلسل) المناطق الفرعية الجينوم التي تم تجميعها ثم الحصول على بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 تسلسل (سليمة أو المعيبة). القيود الثلاثة لهذا النهج: 1) استخدام متعددة يسلسل الإشعال يزيد من خطر عن غير قصد إدخال العيوب في التسلسل بروفيرال، وقد منع عدم التطابق 2) التمهيدي التضخيم من بروفيروسيس خاصة، و 3) غالباً ما تسلسل بروفيرال بأكمله لا يمكن حلها بسبب تقنية من هذه الأساليب.
للتغلب على القيود المفروضة على فيروس نقص المناعة البشرية-1 موجود كامل طول التسلسل بروفيرال فحوصات، قمنا بتطوير وull-Lانجث أنانديفيدوال فروفيرال Sاكوينسينج (تقلب) المقايسة. تقلب الجيل التالي تسلسل (خ ع)-استناداً إلى التحليل الذي يسهب وتسلسل قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (سليمة أو المعيبة) بطريقة عالية الإنتاجية والكفاءة. تقلب يوفر مزايا أكثر من الاختبارات السابقة، كما أنه يحد من عدد أجهزة الإشعال المستخدمة؛ ولذلك، فإنه يقلل فرصة للتمهيدي عدم التطابق، التي قد تحد من سكان بروفيروسيس القبض عليه أو عن غير قصد إدخال العيوب في تسلسل فيروسية. تقلب هو أيضا صعوبة أقل من الناحية الفنية من الاختبارات السابقة وتشمل الخطوات الرئيسية 6: 1) تحلل للمصابين بفيروس نقص المناعة البشرية-1 الخلايا، 2) التضخيم بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 واحدة عن طريق PCR المتداخلة في الحد من التخفيف باستخدام كبسولة تفجير محددة للغاية المصانة HIV-1 5 ‘3’ منطقة U5 لتر (الشكل 1A)، 3 و) تنقية والتحديد الكمي لتضخيم المنتجات، 4) إعداد المكتبة لتضخيم بروفيروسيس خ ع، 5) خ ع، و 6) الجمعية حيثياته من بروفيروسيس متسلسل للحصول على كونتيجس لكل بروفيروس الفردية.
تسلسلات الناجمة عن تقلب يمكن الخضوع لعملية صارمة للقضاء تحديد تلك التي تكون سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون مختصة في النسخ المتماثل (الشكل 1)2. بروفيروسيس سليمة وراثيا تفتقر إلى كل العيوب المعروفة التي تسفر عن توليد بروفيروس غير كفء النسخ المتماثل. وتشمل هذه العيوب: تسلسل انعكاس أو الحذف الداخلية الكبيرة، codons stop هايبرموتيشن/ضارة، فراميشيفتس أو الطفرات 5 ‘ التعبئة والتغليف رئيسي أو إشارة لصق موقع المانحين (MSD).
رقم 1: الخطوات الحاسمة في فحص كامل طول التسلسل بروفيرال الفردية (تقلب). (أ) فيروس نقص المناعة البشرية-1 “الحمض النووي” الجينوم مع مواقع الربط التمهيدي في 5 ‘3’ U5 لتر في منطقتي يستخدمها تقلب إلى تضخيم قرب كامل طول بروفيروسيس فيروس نقص المناعة البشرية-1 (المعيبة وسليمة) عن طريق PCR متداخلة. (ب) تخطيط لوحة بكر 96-جيدا يحتوي على 80 عينة الآبار (آبار 20 لكل تمييع)، 4 آبار المراقبة السلبية، ومراقبة إيجابية 1 جيدا. (ج) عملية الإزالة المستخدمة لتحديد سليمة وراثيا، ويحتمل أن تكون النسخ المتماثل-المختصة، فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وقد تم تعديل هذا الرقم من هينر et al. 2 . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
والرزن تقلب أسلوب كفاءة والفائق لتضخيم وتسلسل واحد, قرب كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وقد حددت عدة عوامل وخطوات حاسمة في البروتوكول التي تؤثر على عدد ونوعية تسلسل الحصول عليها. أولاً، عدد الخلايا وتواتر الإصابة بفيروس نقص المناعة البشرية-1 السكان خلية التأثير على عدد بروفيروسيس تضخيمه. على سبيل المثال، في منشور سابق، ما يقرب من نصف عدد من تسلسل تم الحصول عليها من نفس العدد من السذاجة CD4+ تي الخلايا مقارنة بذاكرة المستجيب CD4+ تي الخلايا. يرجع ذلك إلى أن الخلايا ساذجة وعادة ما يكون تواتر إصابة أقل من الخلايا ذاكرة المستجيب2. وثانيا، تحلل الخلية الأفضل لأساليب الاستخراج المستندة إلى العمود للحصول على الحمض النووي، ليس هناك أي خطر من فقدان الحمض النووي في عملية الاستخراج. وأخيراً، كما الحال مع أي التحليل القائم على بكر، منع التلوث الحرجة. ينبغي تعيين المناطق النظيفة المنفصلين لإعداد يمزج الرئيسي، التعامل مع الحمض النووي، مشيراً إلى عناصر إيجابية وتنقية الحمض النووي والتقدير الكمي، وإعداد مكتبة. هذا مهم خاصة لفحوصات نسخة واحدة مثل تلك المعروضة هنا.
ينبغي أن يتضمن تنفيذ المقايسة تقلب أولاً تشغيل عنصر تحكم إيجابية مثل البلازميدات pNL4-3 بدلاً من عينات المشاركين. هذا سوف يسمح لأي قبل استكشاف الأخطاء وإصلاحها باستخدام فيروس نقص المناعة البشرية-1 الخلايا إيجابية، كما يمكن مقارنة تسلسل الحصول عليها إلى تسلسل المرجعية المتاحة لهذه البلازميدات. عند استخدام الخلايا إيجابية فيروس نقص المناعة البشرية-1، من المهم أن تنظر النوع الفرعي لفيروس نقص المناعة البشرية-1 (كبسولة تفجير مصممة لتقلب محددة للنوع الفرعي ب) وتواتر الإصابة بالسكان الخلية إذا كان قليل من بروفيروسيس لا يتم تضخيمها. تسلسلات التمهيدي يمكن تعديل/إعادة تصميمها لتتناسب مع أنواع فرعية أخرى. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي إدراج جيدا الذي يحتوي على عنصر تحكم إيجابي في PCR كل إجراء.
تقلب والتغلب على القيود المفروضة على فحوصات التسلسل السابق، بما في ذلك الصحة والصحة النباتية. من خلال تضخيم وتسلسلها القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس، يمكن تحديد تقلب النسخ المتماثل-الكفاءات المحتملة من فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. وهذا لم يكن ممكناً استخدام تدابير الصحة النباتية، الذي التسلسل فقط المناطق الفرعية الجينوم والمحدد ولذلك لتسلسل مع مواقع الربط التمهيدي سليمة. وعلاوة على ذلك، وتقلب يتغلب على القيود المرتبطة باستخدام متعددة التضخيم وتسلسل الإشعال، كما كان يعمل في السابق تسلسل كامل طول فحوصات1،4. من خلال جولتين من استهداف المناطق فيروس نقص المناعة البشرية-1 “لتر” جنبا إلى جنب مع خ ع PCR، تقلب يقلل عدد وتعقيد الإشعال المطلوبة. ولذلك تقلب أقل عرضه للنتائج المترتبة على عدم التطابق التمهيدي، إلا وهي تحديد الخاطئة بروفيروسيس المعيبة، وعدم قدرة على تضخيم بعض بروفيروسيس داخل مجموعة من سكان. البروتوكول تقلب هو أيضا أكثر كفاءة، ويسمح لأعلى من الناتج من تسلسل من الأساليب السابقة.
ومن الواضح أن تقلب يوفر مزايا أكثر من الأساليب القائمة التي تحدد التركيب الجيني لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس. ومع ذلك، من المهم أن نعترف بالقيود المفروضة على تقلب. أولاً، مقايسة تقلب لا وضعت كأداة لقياس حجم الخزان فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامنة، كما لم تكتمل بعد تحاليل لتحديد ما إذا كان تقلب يسهب كل بروفيروس فيروس نقص المناعة البشرية-1 الحالي في عدد سكان خلية. تقلب مفيد لإجراء مقارنات نسبية لتكوين الخزان بين خلية مختلفة السكان2بدلاً من ذلك. وثانيا، لا يمكن تحديد اختصاصات سليمة فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس النسخ المتماثل مع اليقين دون في فيفو التحليلات، مثل تلك التي يقوم بها هو وآخرون 4-ثالثا، تقلب ليست مصممة لتحديد موقع إدماج فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس.
ويمكن زيادة الاختلافات الطفيفة في بروتوكول تقلب تطبيقه. على سبيل المثال، التغييرات في التمهيدي يمكن أن تسمح تسلسلات مختلفة ومتعددة الأنواع الفرعية فيروس نقص المناعة البشرية-1 أن تتضخم ومتسلسلة. تسلسل فيريونس البلازما فيروس نقص المناعة البشرية-1 من الممكن عن طريق إضافة التوليف كدنا قبل بكر متداخلة. استخدام أساليب تسلسل جزيء واحد في المستقبل سوف تلغي الحاجة إلى الجمعية حيثياته .
التسلسل الجيني المتكاملة فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس زاد فهمنا لفيروس نقص المناعة البشرية-1 خزان الكامنة. تقلب أداة هامة للدراسات المقبلة توضيح تركيب وتوزيع خزان الكامنة. ومع ذلك، يمكن أن تتجاوز تطبيق تقلب الخزان. قد تستخدم الدراسات المستقبلية تقلب على تحديد أهداف معينة للتكنولوجيا كريسبر-الأكاديمية الصينية للعلوم، أو المساعدة في تحديد الترميز والمناطق غير الترميز الذي يجعل الفيروس أكثر استجابة للكمون عكس وكلاء. جزئ الفيروسية ويمكن فهم أفضل من خلال النظر في مواقع تقاطع الحذف الداخلية الكبيرة.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل مؤسسة بحوث الإيدز ديلاني (داري) لإيجاد علاج (1U19AI096109 و 1UM1AI126611-01)؛ كارمايكل “اتحاد البحوث” المتعلقة “القضاء على” فيروس نقص المناعة البشرية (أرش) “منحة بحثية تعاونية” من “المؤسسة” “أبحاث الإيدز” (امفار 108074-50-رجرل)؛ المركز الأسترالي لفيروس نقص المناعة البشرية والتهاب الكبد الوبائي بحوث علم الفيروسات (ACH2)؛ غيفي UCSF مركز لأبحاث الإيدز (P30 AI027763)؛ والاسترالية الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (AAP1061681). ونود أن نشكر الدكتور جوي لأي، مدير مرفق الجينوميات في معهد “الأبحاث الطبية” لتدريبه في إعداد المكتبة واستخدام مرفق له Westmead، ومركز راماسيوتي لعلم الجينوم (جامعة نيو ساوث ويلز، سيدني، أستراليا) لإجراء تسلسل. ونعترف مع الامتنان المشاركين الذين تبرعوا بالعينات لإجراء هذه الدراسة.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |