רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך) מספקת שיטה יעילה, תפוקה גבוהה עבור הגברה רצף של יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה) HIV-1 הפרו-וירוס והיא מאפשרת קביעה של הפוטנציאל שלהם שכפול-כשירות. סלטות מתגבר על המגבלות של מבחני הקודם שנועדה רצף המאגר HIV-1 סמויה.
וזמינותו Full-Length בודדים Proviral רצף (היפוך) היא שיטה יעילה, תפוקה גבוהה שנועדה להגביר את רצף יחיד, ליד באורך מלא (שלמים ולא פגומה), HIV-1 הפרו-וירוס. סלטות מאפשר קביעת ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב בתוך אוכלוסיה התא. דרך זיהוי פגמים בתוך רצפים proviral HIV-1 המתעוררות במהלך שעתוק במהופך, כגון מחיקות פנימי גדול, עצירה ברישול codons/hypermutation frameshift מוטציות, מוטציות/מחיקות ב- cis מתנהגים הרכיבים הנדרשים עבור virion ההבשלה, סלטות ניתן לזהות משולב הפרו-וירוס מסוגל שכפול. וזמינותו סלטות יכול להיות מנוצל כדי לזהות הפרו-וירוס HIV-1 חסר פגמים אלה, ולכן הם פוטנציאל שכפול-מוסמך. פרוטוקול סלטות כרוך: פירוק של תאים נגועים ב- HIV-1, מקונן PCR של יד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא (באמצעות תחל ממוקד 5 HIV-1′ ו 3′ משמאל לימין), טיהור DNA, כימות, ספריית הכנה עבור הדור הבא רצף (הגדרות), הגדרות, דה נובו הרכבה של proviral contigs, השלילה פשוטה לזיהוי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס. סלטות מספק יתרונות על פני שיטות מסורתיות שנועדה רצף משולב הפרו-וירוס HIV-1, כגון רצף יחיד-proviral. סלטות מגביר את רצף ליד הפרו-וירוס באורך מלא הפעלת שכפול כשירות להיות נחוש, ואתה משתמש גם פחות תחל ההגברה מונע את ההשלכות של אי התאמות פריימר. סלטות הוא כלי שימושי להבנת הנוף גנטי של משולב HIV-1 הפרו-וירוס, בעיקר בתוך המאגר סמויה, עם זאת, ניצול שלו יכול להאריך יישום שבו נדרש ההרכב הגנטי של HIV-1 משולב.
אפיון גנטי של המאגר HIV-1 סמויה, אשר נמשכת אצל אנשים על טיפול תרופתי לטווח ארוך (אמנות), היה חיוני להבנה כי הרוב המכריע של הפרו-וירוס משולבת הם פגומים, פסול השכפול1 , 2. במהלך התהליך של שעתוק במהופך, שגיאות הציג לתוך הרצף proviral משולב. כמה מנגנונים ליצור רצפים proviral פגומים כוללים את מועדת לטעויות האנזים רוורס טרנסקריפטאז HIV-13, תבנית מיתוג4, ו/או APOBEC-induced hypermutation5,6. שני מחקרים שנערכו לאחרונה מצאו כי כ- 5% של הפרו-וירוס HIV-1 מבודד מאנשים על אמנות לטווח ארוך גנטית לא נפגעו, או פוטנציאל שכפול-מוסמך, עשוי לתרום הריבאונד מהירה ב- HIV-1 רמות פלזמה עם הפסקת לאמנות 1 , 2 , 7. הקודם מחקרים זיהו כי שכפול-המוסמכת הפרו-וירוס HIV-1 מתעקש ותמימה. ואת נח זיכרון CD4+ T תא קבוצות משנה (כולל המרכזי, המעבר בתאי T הזיכרון אפקטור), המציין את החשיבות מיקוד אלה תאים בעתיד מיגור אסטרטגיות2,8,9.
בתחילת תובנות בחלוקת, דינמיקה ותחזוקה של המאגר HIV-1 החבויים הושגו דרך הניצול של שיטות רצף יחיד-proviral (SPS) המאפיינות אזורים תת-גנומית של הגנום HIV-110 גנטית ,11,12,13. SPS הוא כלי רב-תכליתי, היכולת רצף provirus יחיד של HIV-1 מ בתוך תא בודד נגועים. SPS זאת, אין אפשרות לקבוע את השכפול-כשירות של הפרו-וירוס, מאז זה רק רצף sub-גנומית אזורים ומתגעגע הפרו-וירוס המכילים מחיקות גדולות בתוך אתרי קישור פריימר. מחקר קודם הראה SPS מגזים בהערכת גודל המאגר שכפול-המוסמכת על ידי 13 – ל 17 פי דרך באופן סלקטיבי רצף שלם אזורים תת-גנומית2.
להתייחס למגבלות של SPS, הו. et al. 4 וברונר. et al. 1 פיתח מבחני לרצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. פעולה זו מותרת התדירות של שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס אצל אנשים על אמנות לטווח ארוך נקבע. אלה מבחני מוגבר, רציף (via סנגר רצף) אזורים תת-גנומית שהורכבו ואז להשיג provirus HIV-1 של רצף (שלמים או פגום). שלוש מגבלות של גישה זו הם: 1) השימוש תחל רצף מרובים מגביר את הסיכון בשוגג היכרות עם פגמים לתוך הרצף proviral, 2) פריימר אי-התאמות עשוי למנוע הגברה של הפרו-וירוס מסוים, ולעתים קרובות 3) לא ניתן לפתור כל רצף proviral עקב טכני השיטות האלה.
כדי להתגבר על המגבלות של קיימים מבחני proviral רצף באורך מלא של HIV-1, פיתחנו Full –Length אניוהקבוצתית Proviral Sequencing (היפוך) וזמינותו. סלטות הוא רצף הדור הבא (הגדרות)-assay מבוסס אשר מגביר את רצף ליד באורך מלא (שלמים או פגומים) HIV-1 הפרו-וירוס באופן תפוקה גבוהה ויעילה. סלטות מספק יתרונות מבחני הקודם, כיוון שהוא מגביל את מספר תחל מנוצל; לכן, זה מקטין את הסיכוי פריימר אי-התאמות, אשר עשוי להגביל את אוכלוסיית הפרו-וירוס שנתפסו או שלא במתכוון להציג פגמים לתוך רצף ויראלי. סלטות הוא גם פחות טכנית מאתגר יותר מבחני הקודם והיא כוללת 6 צעדים עיקריים: תאים 1) פירוק של נגוע ב- HIV-1, 2) הגברה של יחיד הפרו-וירוס HIV-1 באמצעות PCR מקוננים בנטילת הגבלת דילול באמצעות תחל ספציפי עבור שנשמרת מאוד HIV-1 5′ ואזור 3′ U5 LTR (איור 1 א’), 3) טיהור, כימות של מוצרים מוגבר, 4) הכנת ספריה הפרו-וירוס מוגבר על המיתרים, 5) הגדרות, ו-6) דה נובו הרכבה של הפרו-וירוס ברצף כדי לקבל את contigs של כל אחד provirus בודדים.
רצפים שנוצרו על-ידי היפוך יכול לעבור השלילה מחמירים כדי לזהות את אלה אשר ומתפקד פוטנציאל שכפול-כשיר מבחינה גנטית (איור 1C)2. הפרו-וירוס גנטית ללא פגע חסרי כל פגמים ידועה והתוצאה בדור של provirus פסול השכפול. פגמים אלה כוללים: היפוך רצפים, מחיקות פנימי גדול, עצירה hypermutation/ברישול codons, frameshifts או מוטציות בגן 5′ אריזה אות או מרכזי אחוי התורם (MSD).
איור 1: השלבים הקריטיים וזמינותו רצף proviral בודדים באורך מלא (היפוך). (א) ה-HIV-1 DNA הגנום עם אתרי מחייב פריימר 5′ 3′ U5 LTR ואזורים המשמשים סלטות כדי להגביר ליד באורך מלא (פגום ולא תקין) HIV-1 הפרו-וירוס באמצעות PCR מקוננים. הפריסה (B) של צלחת PCR 96-ובכן, המכיל מדגם 80 וולס (20 בארות כל דילול), בארות בקרה שלילית 4 ושליטה חיובי 1. טוב. (ג) תהליך של אלימינציה המשמש לזיהוי שלמים גנטית, ולא פוטנציאל שכפול-המוסמכים, HIV-1 הפרו-וירוס. דמות זו שונתה מ. Hiener et al. 2 . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סלטות וזמינותו היא שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הגברה, רצף יחיד, ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא. גורמים רבים, צעדים קריטיים בפרוטוקול המשפיעים בהתאם למספר ואיכות של הרצף שהושג זוהו. ראשית, מספר התאים ותדירות זיהום ב- HIV-1 של האוכלוסייה תא להשפיע על המספר של הפרו-וירוס מוגבר. לדוגמה, בפרסום הקודם, רצפים רבים חצי לערך, התקבלו מספר זהה של תמים CD4+ T תאים בהשוואה אפקטור זיכרון CD4+ T תאים. זאת משום תמים תאים בדרך כלל יש תדירות זיהום נמוכה יותר מאשר תאי זיכרון אפקטור2. שנית, פירוק תאים עדיפה על עמודה מבוססי החילוץ שיטות לקבלת דנ א גנומי כפי אין סיכון של איבוד DNA בתהליך החילוץ. לבסוף, כמו כל assay מבוססי ה-PCR, מניעת זיהום הוא קריטי. אזורים נקיים מופרדים צריך להיקרא להכנת תערובות מאסטר, טיפול ה-DNA גנומי, הוספת פקדים חיובית, טיהור DNA כימות ואת ספריית הכנה. זה חשוב במיוחד עבור מבחני עותק יחיד כמו זה המוצג כאן.
מימוש וזמינותו סלטות לכלול תחילה להפעיל פקד חיוביים כגון pNL4-3 פלסמידים ולא משתתף דגימות. זה יאפשר לכל מראש לפתרון בעיות לשימוש של תאים חיוביים HIV-1, כפי הרצפים שהתקבלו ניתן להשוות רצפים הפניה זמין עבור פלסמידים אלה. בעת שימוש תאים חיוביים HIV-1, חשוב לשקול את סוג המשנה של HIV-1 (primers המיועדות סלטות הספציפיים סוג B) ותדירות זיהום של האוכלוסייה תא אם מעט לא הפרו-וירוס הם מוגבר. רצפים פריימר יכול להיות שונה/מחדש כדי להתאים את תתי סוגים אחרים. בנוסף, טוב המכיל פקד חיובי צריכים להיכלל בכל PCR שבוצעה.
סלטות יש להתגבר על המגבלות של מבחני רצף קודמות, לרבות SPS. באמצעות הגברה ורצף ליד הפרו-וירוס HIV-1 באורך מלא, סלטות ניתן לקבוע את כשירות-השכפול פוטנציאלי של הפרו-וירוס HIV-1. זה לא היה אפשרי באמצעות SPS, אשר וסודרו רק אזורים תת-גנומית ונבחר לכן רצפי עם אתרי קישור פריימר ללא פגע. יתר על כן, סלטות מתגבר על המגבלות הקשורות ניצול מרובים הגברה, רצף תחל כפי הועסק על ידי הקודם רצף באורך מלא מבחני1,4. דרך שני סיבובים של PCR פילוח אזורי HIV-1 LTR בשילוב עם הגדרות, סלטות מקטין את מספר ואת המורכבות של צבעי יסוד הנדרש. הטלות ולכן פחות רגישים ההשלכות של פריימר אי-התאמות, כלומר זיהוי שגוי של הפרו-וירוס פגומה וחוסר יכולת להגביר קצת הפרו-וירוס בתוך אוכלוסיה. פרוטוקול סלטות גם יעיל יותר ומאפשר תפוקה גבוהה יותר של רצף מאשר שיטות קודמות.
אין ספק, סלטות מספק יתרונות על פני שיטות קיימות אשר קובעים את ההרכב הגנטי של HIV-1 הפרו-וירוס…. עם זאת, חשוב להכיר את המגבלות של סלטות. ראשית, וזמינותו סלטות לא פותחה ככלי למדידת גודל המאגר HIV-1 סמויה, כמו ניתוח כדי לקבוע אם סלטות מגביר את כל provirus HIV-1 נוכח אוכלוסיה תא שלא הושלמו. סלטות שימושית במקום ביצוע השוואות היחסי של ההרכב של המאגר בין אוכלוסיות תאים שונים2. שנית, השכפול-כשירות של שלם הפרו-וירוס HIV-1 לא ניתן לקבוע בוודאות. בלי ניתוחים ויוו , כגון אלה המבוצעות על ידי הו. et al. 4. שלישית, סלטות לא נועד לקבוע האתר אינטגרציה של הפרו-וירוס HIV-1.
הבדלים קלים בפרוטוקול סלטות באפשרותך להגביר את היישום שלה. לדוגמה, שינויים פריימר רצפים יכול לאפשר שונים ובסוגי HIV-1 מרובים להיות מוגבר ולא רציף. רצף של פלזמה HIV-1 virions אפשרי באמצעות התוספת של סינתזה cDNA לפני ה-PCR מקוננים. ניצול עתידי של מולקולה בודדת רצף שיטות יבטל את הצורך דה נובו הרכבה.
רצף גנטי של הפרו-וירוס HIV-1 משולב הגבירה את ההבנה שלנו של המאגר HIV-1 סמויה. סלטות היא כלי חשוב עבור מחקרים עתידיים שחקרתי את הרכב ופיזור של המאגר סמויה. עם זאת, היישום של סלטות באפשרותך להרחיב מעבר המאגר. מחקרים עתידיים עשויים לנצל הטלות כדי לקבוע מטרות מסוים לטכנולוגיה CRISPR-Cas, או לסייע בזיהוי של קידוד ואזורים ללא קידוד ההופכים את הווירוס קשובים יותר השהיה היפוך סוכנים. רקומבינציה ויראלי כפי שניתן להבין טוב יותר על ידי הסתכלות על האתרים צומת של מחיקות פנימיים גדולים.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה דלייני איידס המחקר של הארגון (האתגר) כדי למצוא תרופה (1U19AI096109 ו- 1UM1AI126611-01); amfAR קונסורציום מחקר ב- HIV מיגור (ARCHE) מענק מחקר שיתופי של הקרן לחקר האיידס (amfAR 108074-50-RGRL); מרכז אוסטרלי HIV ומחקר וירולוגיה הפטיטיס (ACH2); מרכז קליפורניה בסן פרנסיסקו-GIVI לחקר האיידס (P30 AI027763); הבריאות הלאומי האוסטרלי ואת מועצת המחקר הרפואי (AAP1061681). ברצוננו להודות ד ר ג’ואי לאי גנומיקה מנהל מתקן במכון Westmead למחקר רפואי את הכשרתו ספריית הכנה ושימוש המיומנות שלו, המרכז Ramaciotti גנומיקה (אוניברסיטת של ניו סאות וויילס, סידני, אוסטרליה) לביצוע רצף. אנו להכיר בהכרת המשתתפים שתרמה דגימות במחקר זה.
UltraPure 1 M Tris-HCI, pH 8.0 | Invitrogen | 15568025 | Dilute to 5 mM for nested PCR |
Nonidet P 40 Substitute solution | Sigma | 98379 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
Proteinase K Solution (20 mg/mL) | Promega | AM2548 | |
96 well thermocycler | Any 96 well thermocycler can be used | ||
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304011 | |
10X High Fidelity Buffer [600 mM Tris-SO4 (pH 8.9), 180 mM (NH4)2SO4] | Invitrogen | 11304011 | |
50 mM MgSO4 | Invitrogen | 11304011 | |
PCR Nucleotide Mix, 10 mM | Promega | C1141 | |
Ultrapure H2O | Invitrogen | 10977023 | |
PCR1 and PCR2 Primers | Desalted. Dilute to (100 M) with H2O | ||
PCR Plate 96 Well, Half Skirt, Single Notch Corner, Clear | Axygen | PCR-96M2-HS-C | |
Microseal 'B' Adhesive Seals | BioRad | MSB1001 | Required to seal 96 well PCR plates |
HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) | The following reagent was obtained through the NIH AIDS Reagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH: HIV-1 NL4-3 Infectious Molecular Clone (pNL4-3) from Dr. Malcolm Martin (Cat# 114). | Diluted to 10^5 copies/mL and used as positive control | |
PCR plate spinner or benchtop centrifuge | |||
E-GEL 48 1% Agarose | Invitrogen | G800801 | Precast 1% agarose gels (two gels used per 96 well plate). Any 1% agarose gel can be substituted. Contains ethidium bromide. |
DirectLoad Wide Range DNA Marker | Sigma | D7058 | Any ladder with a range up to 10 kb can be substituted |
Mother E-Base device | Invitrogen | EBM03 | Required for running precast 48 well 1% agarose gels |
Gel Doc EZ Gel Documentation System | BioRad | 1708270 | Any visualisation system for ethidium bromide containing agarose gels can be used |
PlateMax Peelable Heat Sealing | Axygen | HS-200 | Heat sealing film for long term storage |
96 Well 0.8 mL Storage Plate | ThermoFisher Scientific | AB0765 | 0.8 mL 96 well plate required for magnetic bead based PCR purification |
Agencourt AMPure XP (PCR purification kit) | Beckman Coulter | A63880 | Magnetic bead based PCR purification kit. Other PCR purification kits can be substitued here (e.g. QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Cat#28106) |
Ethyl alcohol, Pure. 200 proof, for molecular biology | Sigma | E7023 | |
Magnetic Stand-96 | Invitrogen | AM10027 | |
Microplate shaker | Optional | ||
Buffer EB | Qiagen | 19086 | Elution buffer |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Invitrogen | P11496 | A fluorescence based stain for measuring dsDNA concentration |
Microplate reader | |||
Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1096 | |
Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-2001 | |
Hard-Shell 96-Well PCR Plates | Biorad | HSP9601 | Required for Nextera XT DNA library preparation kit |
Library Quantification Kit – Illumina/Universal | Kapa Biosystems | KK4824 | Other library quantification kits can be substitued (e.g. JetSeq DNA Library Quantification Lo-Rox Kit (Bioline Cat#BIO-68029) |
2100 Bioanalyzer | Agilent Technology | Automated electrophoresis system . Use in conjunction with a High Sensistivity DNA kit | |
High Sensistivty DNA kit | Agilent Technology | 5067-4626 | |
Illumina MiSeq Platform | Illumina |