Extracción de ADN de alto rendimiento y genotipificación de 3dpf larvas de pez cebra por recorte de aleta
Summary
Pez cebra se han utilizado como organismos modelo genética fiable en la investigación biomédica, especialmente con el advenimiento de las tecnologías de edición de gene. Cuando se esperan fenotipos larvales, identificación de extracción y genotipo de ADN puede ser difícil. Aquí, describimos un procedimiento eficiente de genotipado para larvas de pez cebra, por cola de recorte, tan pronto como 72 h post fertilización.
Abstract
Pez cebra (Danio rerio) poseen orthologues 84% de los genes conocidos por estar asociados con enfermedades humanas. Además, estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones. Los avances recientes en gene de herramientas de edición permiten precisa introducción de mutaciones y los transgenes en el pez cebra. Modelado en el pez cebra a menudo la enfermedad conduce a fenotipos larvas y muerte temprana que puede ser difícil de interpretar si genotipos son desconocidos. Esta temprana identificación de genotipos es también necesaria en los experimentos que requieren muestra puesta en común, como en estudios de gene expresión o masa espectrometría. Sin embargo, amplia selección genotípica está limitada por los métodos tradicionales, que en la mayoría de los laboratorios se realizan sólo en pez cebra adulto o larvas post mortem. Abordamos este problema mediante la adaptación de un método para el aislamiento de ADN genómico de PCR-listo de larvas de pez cebra vivo que se puede lograr tan pronto como fertilización después de 72 h (hpf). Esta vez y técnica rentable, mejoró a partir de un protocolo de genotipificación publicados anteriormente, permite la identificación de genotipos procedentes de biopsias de fin microscópica. Las aletas se regeneran rápidamente como desarrollan de las larvas. Los investigadores entonces son capaces de seleccionar y criar los genotipos deseados a la edad adulta mediante la utilización de este procedimiento de genotipificación basada en PCR de alto rendimiento.
Introduction
El pez cebra (rerio del Danio) es un organismo vertebrado, ampliamente utilizado como modelo para la investigación de la enfermedad así como para ensayos preclínicos de hipótesis terapéuticas1,2,3. Estos animales tienen un tiempo de generación corto, son fáciles de manejar, mostrar una alta tasa reproductiva, bajo costo y son fácilmente susceptibles de manipulaciones genéticas por microinyección de ADN en embriones4. A través del desarrollo creciente de novela transgénico y genes edición tecnologías como Zinc-Finger nucleasas (ZFN)5, TAL como efectoras nucleasas (TALENs)6,7y el cluster regularmente otro corto Palindrómico repite (CRISPR) / CRISPR asociados 9 (Cas9) sistema8, el pez cebra va a mejorar sustancialmente la comprensión de varias condiciones patológicas. Estas tecnologías se han utilizado para crear knockouts dirigidas tanto somáticas y células germinales en el pez cebra, eficientemente engendrar genéticamente modificación animales8. Ejemplos recientes en la literatura incluyen el desarrollo de modelos genéticos de la epilepsia y trastornos metabólicos en el pez cebra3,9,10,11,12 .
Con los progresos realizados en la edición del genoma del pez cebra, genotipificación rápida y confiable se ha convertido en un indiscutible paso de limitación de velocidad. Identificación de mutaciones de ADN específicas junto al sitio de destino prevista-edición genómica es una etapa esencial del protocolo. Técnicas de genotipado por recorte de aleta son tradicionalmente, generalmente sólo en juveniles o adultos pez cebra. Sin embargo, el tiempo invertido en pez cebra aumento a la edad adulta (> 2 meses) retrasa considerablemente los avances en la investigación. En muchos casos, la edad adulta no puede lograrse por el knockout de genes esenciales (por ejemplo, en el modelado de la enfermedad) o ganar-de-función mutaciones conducen a efectos fenotípicos perjudiciales. Además, diversos estudios requieren la puesta en común de las larvas, tales como extracción de ARN o metabolito y así involucran previa identificación de los genotipos, que puede ser difícil cuando se dispone de técnicas de genotipado único post hoc . Estos ejemplos mencionados destacan la importancia de las técnicas de Genotipado de larvas que son al mismo tiempo precisa y permitir la recuperación completa y el desarrollo normal de las larvas. Genotipificación de pez cebra de etapa temprana actualmente parece no ser utilizado; Esto se refleja en publicaciones recientes de modelos de la enfermedad en la que genotipos larvarios se identifican mediante Genotipado de post-mortem en lugar de genotipado antes de la ejecución del experimento12,13,14. En este trabajo, se presenta una estrategia de clip de larvas de aleta con el objetivo de mejorar los procedimientos de genotipado previamente establecidas.
En el pasado, estrategias que emplea digestión proteinasa K a genotipo viven pez cebra larvas han llevado a polimerasa variable de eficiencia de la reacción en cadena (PCR)15. Aunque más recientemente publicaron la técnica de biopsia de cola microscópica proporcionada resultados más prometedores16, nosotros y otros grupos no fueron capaces de reproducir la alta eficiencia y recuperación de ADN, reportado por los autores. Un retroceso importante del protocolo descrito por Wilkinson et al. 16 podría ser la transferencia del tejido de la cola en el tubo PCR. Debido a su tamaño microscópico, es difícil para que la aleta fue debidamente recopilada y dispensada por pipeteo. Para hacer frente a esta barrera, hemos desarrollado un protocolo mejorado para un gran número de Genotipado de larvas de pez cebra vivo con casi 100% de eficiencia9. Con un microscalpel, la punta de la cola de la aleta se retira y coloca en un pedazo de papel de filtro. El pedazo de papel de filtro que contiene el tejido puede ser fácilmente visualizado y correctamente colocado en un tubo PCR. Se realiza la extracción de ADN genómica, seguido de la amplificación por PCR de la región de interés a genotipo la muestra. Las ventajas de este método incluyen una alta eficiencia PCR, un bajo índice de falsos positivos y una tasa de mortalidad baja. Además, Genotipado de un gran número de embriones es posible usando este protocolo. El protocolo descrito en el presente documento permite aleta-recorte de cientos de larvas dentro de 2-3 h con este enfoque y la correcta identificación de peces genotipo y regeneración de la cola dentro de dos días.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gen se han empleado herramientas de edición precisamente introducir mutaciones y los transgenes en el pez cebra en los últimos años5,6,7,8. Cuando se realiza la enfermedad en pez cebra, primeros fenotipos larvales o juveniles a menudo se observan9,12,13,14. El prot…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a los modelos raros de la enfermedad y mecanismo (RDMM) red (financiada por los institutos canadienses de investigación de salud (CIHR) y genoma Canadá). CK es apoyada por una beca de la UROP (Universidad de Ottawa). DLJ es apoyado por una beca postgrado Vanier Canadá. IAP es apoyado por un premio de beca postdoctoral de institutos canadienses de investigación de salud (CIHR). Los autores agradecen la Genetics Society of America para la concesión de permiso para publicar este protocolo y utilizar una adaptación de la figura 5 suplementarios de Pena, et al.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
Referências
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genética. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
