استخراج الحمض النووي الفائق والتنميط 3dpf الزرد يرقات بالقطع Fin
Summary
وقد استخدمت الزرد كالكائنات نموذج الوراثية الموثوقة في البحوث الطبية الحيوية، لا سيما مع ظهور تكنولوجيات تحرير الجينات. عندما تعمل اليرقات المتوقع، تحديد النمط الوراثي واستخراج الحمض النووي يمكن أن يكون تحديا. هنا، نحن تصف إجراء التنميط تتسم بكفاءة لليرقات الزرد، بقطع الذيل، أقرب وقت الإخصاب بعد 72-ح.
Abstract
الزرد (دانيو rerio) تمتلك أورثولوجويس 84 في المائة من الجينات معروفة مرتبطة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة. وتمكن التقدم الذي أحرز مؤخرا في الجينات أدوات تحرير دقيقة مقدمة للطفرات والمتسلسلات في الزرد. المرض النمذجة في الزرد غالباً ما يؤدي إلى تعمل اليرقات والوفاة المبكرة التي يمكن أن يكون تحديا لتفسير إذا كانت الأنماط الوراثية غير معروفة. هذا التحديد المبكر للأنماط الجينية أيضا المطلوبة في التجارب التي تتطلب تجميع عينة، مثل الجينات التعبير أو كتلة دراسات قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك، يقتصر فحص واسعة النطاق قد بالطرق التقليدية، التي يتم تنفيذها فقط في الزرد الكبار أو في تشريح الجثة اليرقات في معظم مختبرات. لقد عالجت هذه المشكلة بتكييف أسلوب لعزل الحمض النووي جاهزة لبكر من اليرقات الحية الزرد التي يمكن أن يتحقق في أقرب وقت الإخصاب بعد ح 72 (hpf). هذا الوقت وتقنية فعالة من حيث التكلفة، وتحسن من بروتوكول التنميط منشورة سابقا، يتيح تحديد الأنماط الجينية من خزعات زعنفة مجهرية. بسرعة تجديد الزعانف تتطور اليرقات. ثم الباحثين قادرة على تحديد ورفع الوراثية المطلوبة لمرحلة البلوغ باستخدام هذا الفائق إجراء التنميط القائم على بكر.
Introduction
الزرد (دانيو rerio) هو أحد الكائنات الفقارية المستخدمة على نطاق واسع كنموذج للتحقيق المرض، وكذلك فيما يتعلق بالتجارب الإكلينيكية للفرضيات العلاجية1،،من23. هذه الحيوانات يكون وقت جيل قصيرة وسهلة للتعامل معها، وعرض ارتفاع معدل الإنجاب، منخفضة تكلفة، وقابلة بسهولة للتلاعب الجيني ب microinjection من الحمض النووي في الأجنة4. من خلال التطور المتزايد للرواية المعدلة وراثيا والجينات تحرير تكنولوجيات مثل إصبع الزنك nucleases (زفن)5،6،مثل تل المستجيب Nucleases (تالينس)7، و “تجمع بانتظام إينتيرسباسيد قصيرة” المتناوب ويكرر (كريسبر)/المرتبطة كريسبر 9 (Cas9) نظام8، الزرد تستعد لتحسين فهم عدة شروط مرضية إلى حد كبير. استخدمت هذه التكنولوجيات لإنشاء المستهدفة بالضربة القاضية في على حد سواء جسدية وتعديل الخلايا germline في الزرد، كفاءة توليد وراثيا للحيوانات8. وتشمل الأمثلة الأخيرة في الأدب التنمية الناجحة للنماذج الوراثية للصرع واضطرابات التمثيل الغذائي في الزرد3،،من910،11،12 .
مع التقدم المحرز في تحرير الجينوم الزرد، أصبح التنميط سريعة وموثوق بها خطوة الحد من معدل لا يمكن إنكاره. تحديد محددة طفرات الحمض النووي المجاورة لموقع الهدف توقع تحرير الجينوم مرحلة أساسية من البروتوكول. تقليديا، عادة ما تكون تقنيات التنميط بالقطع زعنفة الزرد المؤداة في الأحداث أو الكبار فقط. إلا أن الوقت الذي يقضيه الزرد رفع إلى سن البلوغ (> 2 أشهر) إلى حد كبير تأخير التقدم في البحوث. في كثير من الحالات، لا يمكن تحقيق مرحلة البلوغ بسبب التقديم من الجينات الأساسية (مثلاً، في نمذجة المرض) أو مكسب للدالة الطفرات تؤدي إلى آثار ضارة المظهرية. وباﻹضافة إلى ذلك، فحوصات عدة تتطلب تجميع اليرقات، مثلما حدث في استخراج الحمض النووي الريبي أو المستقلب، وهكذا تنطوي على تحديد مسبق للأنماط الجينية، التي يمكن أن تكون صعبة عندما تتوفر تقنيات التنميط فقط وظيفة المخصصة . هذه الأمثلة المذكورة أعلاه تبرز أهمية تقنيات التنميط اليرقات وهي في نفس الوقت الدقيق وتمكين الانتعاش الكامل والتطور الطبيعي لليرقات. التنميط الزرد المرحلة المبكرة لا يظهر حاليا لاستخدامها على نطاق واسع؛ ويتجلى هذا المنشورات الأخيرة لنماذج الأمراض الوراثية اليرقات التي حددت عن طريق التنميط الجثة بدلاً من التنميط قبل تنفيذ التجربة12،،من1314. في هذه الورقة، يرد مقطع زعنفة يرقات استراتيجية تهدف إلى تحسين إجراءات التنميط المحددة سابقا.
في الماضي، تعيش استراتيجيات توظيف الهضم بروتيناز ك للنمط الوراثي الزرد اليرقات أدت إلى متغير بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) كفاءة15. على الرغم من أن أكثر مؤخرا بنشر تقنية خزعة ذيل مجهرية قدمت نتائج واعدة أكثر16، نحن ومجموعات أخرى لم تكن قادرة على إنتاج عالية الكفاءة واسترداد الحمض النووي أفاد مقدمو البلاغ. نكسة كبيرة للبروتوكول، المذكورة ويلكنسون et al. يمكن أن يكون 16 نقل الأنسجة الذيل إلى أنبوب PCR. نظراً لحجمها المجهري، من الصعب ضمان أن fin التي تم جمعها بشكل صحيح والاستغناء عن طريق بيبيتينج. ولمعالجة هذا العائق، وضعنا بروتوكولا محسنة للتنميط أعدادا كبيرة من اليرقات الزرد العيش مع ما يقرب من 100 ٪ كفاءة9. استخدام ميكروسكالبيل، إزالة غيض من زعنفة الذيل وتوضع على قطعة من ورق الترشيح. ويمكن تصور سهولة قطعة ورق الترشيح التي تحتوي على الأنسجة ووضعها بشكل صحيح في أنبوب PCR. ثم يتم استخراج الحمض النووي الجينوم، تليها [بكر] تضخيم المنطقة من الفائدة للنمط الوراثي العينة. وتشمل مزايا هذا الأسلوب من كفاءة PCR عالية، وانخفاض معدل إيجابية كاذبة ومعدل وفيات منخفض. بالإضافة إلى ذلك، التنميط عدد كبير من الأجنة من الممكن استخدام هذا البروتوكول. يسمح البروتوكول الخاص الموضحة هنا زعنفة-قطع مئات من اليرقات داخل ح 2-3 باستخدام هذا النهج وتحديد الهوية الصحيحة من الأسماك جينوتيبيد والتجدد الذيل في غضون يومين.
Protocol
Representative Results
Discussion
الجينات قد استخدمت أدوات التحرير التحديد استحداث الطفرات والمتسلسلات في الزرد على مدى سنوات5،6،،من78. تعمل اليرقات أو الأحداث المبكرة عند أداء مرض النمذجة في الزرد، كثيرا ما يلاحظ9،12،…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر نماذج الأمراض النادرة والشبكة الآلية (ردمم) (تموله المعاهد الكندية للبحوث الصحية (استوفوا) وكندا الجينوم). كورونا تشيكية معتمد من قبل على جائزة منحة أوروب (جامعة أوتاوا). دلج تدعمه “منحة Vanier كندا العليا”. ويدعم الأكاديميات بمنح زمالات ما بعد الدكتوراه في معاهد كندية لبحوث صحية (استوفوا). يشكر المؤلفون في “علم الوراثة الجمعية الأمريكية” لمنح الإذن لنشر هذا البروتوكول واستخدام لتكيف من 5 الرقم الإضافي من بينا، وآخرون.
Materials
| Petri dish | Corning | 430167 | |
| Microscalpel | World Precision Instruments | 500249 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Tricaine/Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 96-well Tissue-culture plate | Costar | 3595 | |
| 96-well PCR plate | Fisher | 14230232 | |
| NaOH | Fisher | S25548A | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| 5% Chelex 100 sodium form | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| GelRed 1x | Biotium | 41003 | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768 | |
| Sub-Cell Model 192 system | Bio-Rad | 1704508 | |
| 30 % Acrylamide/Bis Solution, 37.5: 1 | Bio-Rad | 1610158 | |
| GoTaq Green Master Mix, 2X | Promega | M7123 | |
| paper wipes (Kimwipes® disposable wipers) | Sigma-Aldrich | Z188956 | |
| 1kb-plus molecylar weight marker | Thermo Scientific | SM1343 | |
| Nuclease free water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| Sub-Cell Model 192 system (high-throughput agarose gel system) | Bio-Rad | 1704508 | |
| vertical gel electrophoresis system Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 1658004 |
Referências
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), (2013).
- Stewart, A. M., Kalueff, A. V. Developing better and more valid animal models of brain disorders. Behav Brain Res. 276, 28-31 (2015).
- Grone, B. P., Baraban, S. C. Animal models in epilepsy research: legacies and new directions. Nat Neurosci. 18 (3), 339-343 (2015).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Doyon, Y., et al. Heritable targeted gene disruption in zebrafish using designed zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol. 26 (6), 702-708 (2008).
- Bedell, V. M., et al. In vivo Genome Editing Using High Efficieny TALENs. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Sander, J. D., et al. Targeted gene disruption in somatic zebrafish cells using engineered TALENs. Nat Biotechnol. 29 (8), 697-698 (2012).
- Hwang, W. Y., et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nat Biotechnol. 31 (3), 227-229 (2013).
- Pena, I. A., et al. Pyridoxine-Dependent Epilepsy in Zebrafish Caused by Aldh7a1 Deficiency. Genética. 207, 1501-1518 (2017).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, 2410 (2013).
- Godoy, R., Noble, S., Yoon, K., Anisman, H., Ekker, M. Chemogenetic ablation of dopaminergic neurons leads to transient locomotor impairments in zebrafish larvae. J Neurochem. 135, 249-260 (2015).
- Scheldeman, C., et al. Neurobiology of Disease mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebra fish Phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108 (September), 225-237 (2017).
- Zabinyakov, N., et al. Characterization of the first knock-out aldh7a1 zebrafish model for pyridoxine-dependent epilepsy using CRISPR-Cas9 technology. PLoS One. 12 (10), 1-14 (2017).
- Grone, B. P., et al. Epilepsy, behavioral abnormalities, and physiological comorbidities in syntaxin-binding protein 1 (STXBP1) mutant zebrafish. PLoS One. 11 (3), (2016).
- Kawakami, K., Hopkins, N. Rapid identification of transgenic zebrafish. Trends Genet. 12 (1), 9-10 (1996).
- Wilkinson, R. N., Elworthy, S., Ingham, P. W., van Eeden, F. J. M. A method for high-throughput PCR-based genotyping of larval zebrafish tail biopsies. Biotechniques. 55 (6), 314-316 (2013).
- Zhu, X., et al. An efficient genotyping method for genome-modified animals and human cells generated with CRISPR/Cas9 system. Sci Rep. 4, 6420 (2014).
- Walsh, P. S., Metzger, D. A., Higuchi, R. Chelex 100 as a medium for simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques. 54 (3), 506-513 (2013).
- Ewing, B., Green, P. Basecalling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Res. 8, 175-185 (1998).
