मात्रात्मक सेल Neurodegeneration की Drosophila में फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन ImageJ का उपयोग कर के निष्पक्ष विश्लेषण के माध्यम से जीवविज्ञान
Summary
हम एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह विकसित किया है प्रतिदीप्ति से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए-इमेजिंग-आधारित सेल जैविक अध्ययन के प्रोटीन एकत्रीकरण और autophagic फ्लक्स के केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में Drosophila मॉडल के neurodegeneration ।
Abstract
neurodegenerative रोगों की बढ़ती व्यापकता के साथ, यह तेजी से महत्वपूर्ण है कि अंतर्निहित pathophysiology को समझने के लिए है कि ंयूरॉन रोग और हानि की ओर जाता है । प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग उपकरण और प्रौद्योगिकियों उपसेलुलर neurobiological प्रक्रियाओं का अभूतपूर्व विश्लेषण सक्षम है, अभी तक वहां अभी भी निष्पक्ष, reproducible के लिए एक की जरूरत है, और इमेजिंग अध्ययन से quantifiable डेटा निकालने के लिए सुलभ दृष्टिकोण . हम neurodegeneration के Drosophila मॉडल का उपयोग प्रतिदीप्ति आधारित इमेजिंग अध्ययनों से मात्रात्मक डेटा को निकालने के लिए एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह विकसित किया है. विशेष रूप से, हम दो सेलुलर प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए फिजी/ImageJ का उपयोग कर एक आसान पालन, अर्द्ध स्वचालित दृष्टिकोण का वर्णन: पहले, हम Drosophila ऑप्टिक पालि में फ्लोरोसेंट-टैग उत्परिवर्ती का उपयोग प्रोटीन समग्र सामग्री और प्रोफ़ाइल यों तो । huntingtin प्रोटीन; और दूसरा, हम ratiometric के साथ Drosophila दृश्य प्रणाली में autophagy-lysosome फ्लक्स-ठहराव के एक मिलकर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर के autophagy आधारित आकलन । महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल यहां उल्लिखित एक अर्द्ध स्वचालित विभाजन कदम सभी फ्लोरोसेंट संरचनाओं को सुनिश्चित करने के लिए चयन पूर्वाग्रह को कम करने और सूक्ष्म तुलना के संकल्प को बढ़ाने के विश्लेषण कर रहे है शामिल हैं । इस दृष्टिकोण के अंय सेल जैविक संरचनाओं और neurodegeneration में फंसा प्रक्रियाओं के विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है, जैसे proteinaceous puncta (तनाव granules और synaptic परिसरों), साथ ही झिल्ली बंधे डिब्बों (mitochondria और झिल्ली ्े बुलबुले) । इस विधि छवि विश्लेषण और ठहराव के लिए एक मानकीकृत, अभी तक अनुकूलनीय संदर्भ बिंदु प्रदान करता है, और क्षेत्र भर में विश्वसनीयता और reproducibility की सुविधा सकता है, और अंततः neurodegeneration की यंत्रवत समझ में वृद्धि ।
Introduction
Neurodegenerative रोगों हर साल लाखों लोगों को प्रभावित और घटना एक उंर बढ़ने आबादी1के साथ बढ़ रही है । जबकि प्रत्येक neurodegenerative रोग एक अद्वितीय एटियलजि है, विश्लेषण प्रोटीन और proteostasis नेटवर्क के टूटने के एकत्रीकरण इन रोगों के कई रोग की पहचान आम हैं । Elucidating कैसे इन मौलिक और संबंधित प्रक्रियाओं के विघटन गड़बड़ा जाता है के लिए ंयूरॉन रोग और कोशिका मृत्यु में योगदान neurodegenerative रोगों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उपचारात्मक हस्तक्षेप मार्गदर्शन । प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग न्यूरॉन्स में इन जटिल और गतिशील प्रक्रियाओं की जांच के लिए अनुमति देता है और बहुत न्यूरॉन्स सेल जीव विज्ञान की हमारी समझ के लिए योगदान दिया है. फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन का विश्लेषण चुनौतीपूर्ण है, खासकर जब प्रयोग vivo मेंकिया जाता है, अत्यधिक कॉंपैक्ट ऊतकों के कारण, विविध कोशिका प्रकार, और रूपात्मक विविधता । मैंयुअल रूप से सहायता ठहराव सस्ती और सीधा है, लेकिन अक्सर समय लेने वाली और मानव पूर्वाग्रह के अधीन है । इसलिए, वहां निष्पक्ष, reproducible, और इमेजिंग अध्ययन से quantifiable डेटा निकालने के लिए सुलभ दृष्टिकोण के लिए एक की जरूरत है ।
हम फिजी/ImageJ, एक शक्तिशाली और स्वतंत्र रूप से सुलभ छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर2,3, के प्रयोगात्मक मॉडल में प्रतिदीप्ति इमेजिंग अध्ययन से मात्रात्मक डेटा निकालने के लिए का उपयोग कर एक सरल और अनुकूलनीय कार्यप्रवाह रेखांकित किया है neurodegeneration प्रयोग Drosophila। इस प्रोटोकॉल का पालन करके प्रोटीन एकत्रीकरण और autophagic फ्लक्स-दो कोशिका जैविक विशेषताएं है कि अत्यधिक neurodegenerative रोग विकृति विज्ञान के लिए प्रासंगिक है-हम संवेदनशीलता और इस दृष्टिकोण के reproducibility का प्रदर्शन किया । Drosophila ऑप्टिक पालि में फ्लोरोसेंट टैग उत्परिवर्ती huntingtin (Htt) प्रोटीन का विश्लेषण संख्या, आकार, और प्रोटीन समुच्चय की तीव्रता का पता चला । हम Drosophila दृश्य प्रणाली है, जो अलग उत्सर्जन कंपार्टमेंट पर्यावरण4के आधार पर संकेत प्रदर्शित करता है के भीतर autophagic फ्लक्स के एक मिलकर फ्लोरोसेंट रिपोर्टर visualized । Ratiometric-मिलकर रिपोर्टर के विश्लेषण आधारित autophagosome गठन, परिपक्वता से autophagy-lysosome प्रवाह के एक मात्रात्मक और व्यापक देखने के लिए अनुमति दी, और lysosome में गिरावट के लिए परिवहन, और इसके अलावा कमजोर प्रकाश डाला neurodegenerative परिस्थितियों में डिब्बों में खलल डाला । महत्वपूर्ण बात, दोनों विश्लेषण में हम अपने प्रोटोकॉल में अर्द्ध स्वचालित थ्रेसहोल्ड और विभाजन कदम लागू करने के लिए बेहोश पूर्वाग्रह को कम करने, नमूना शक्ति में वृद्धि, और एक मानक प्रदान करने के लिए समान अध्ययन के बीच तुलना की सुविधा । सरल कार्यप्रवाह को शक्तिशाली फिजी/ImageJ plugins (कंप्यूटर वैज्ञानिकों द्वारा विकसित गणित एल्गोरिदम के आधार पर) अधिक neurobiologists और बड़े पैमाने पर जीवन विज्ञान समुदाय के लिए सुलभ बनाने का इरादा है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल को मजबूती से इस्तेमाल किया जा सकता है और reproducibly quantitate कोशिका जैविक प्रतिदीप्ति-आधारित इमेजिंग द्वारा visualized प्रक्रियाओं । जैविक संदर्भ और तकनीकी सीमाओं को सावधानीपूर्वक प्रायोगि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम शीला और डेविड Fuente Neuropathic दर्द अनुसंधान कार्यक्रम स्नातक फैलोशिप (J.M.B. के लिए), Lois पोप जीवन अध्येता कार्यक्रम (के लिए टिपू, Y.Z., और J.M.B.), स्नाइडर-रॉबिंसन फाउंडेशन डॉक्टरी फैलोशिप (को टिपू), डॉ जॉन टी द्वारा समर्थित है . मैकडोनाल्ड फाउंडेशन (टिपू करने के लिए), अनुबंध, स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान (NIH) HHSN268201300038C, R21GM119018, और R56NS095893 (R.G.Z. के लिए), और Taishan विद्वान परियोजना (शेडोंग प्रांत, पीपुल्स रिपब्लिक ऑफ चाइना) (to R.G.Z.) ।
Materials
| SYLGARD(R) 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | PF184250 | Dissection dish |
| Falcon 35 mm Not TC-Treated Easy-Grip Style Bacteriological Petri Dish | Corning | 351008 | Dissection dish |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dissection tool |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | PBS solution |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma | S5136 | PBS solution |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | P5655 | PBS solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | Washing and antibody incubaton solution. |
| 37% Formaldehyde | VWR | 10790-710 | Fixation |
| Disposable Microcentrifuge Tubes (0.5mL, blue) | VWR | 89000-022 | Fixation, washing, and antibody incubaton. |
| Plain and Frosted Micro Slides (25×75mm) | VWR | 48312-004 | Slides for confocal imaging |
| Micro Cover Glasses, rectangular (22×40mm) | VWR | 48393-172 | Slides for confocal imaging |
| Rubber Cement | Slime | 1051-A | Mounting |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting |
| Scotch Magic 810 Invisible Tape (19mm×25.4m) | 3M Company | 810 | Mounting |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | Antibody incubaton |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | Nucleic acid staining. Dissolve in deionized water to make a 5 mg/mL stock solution and store at -80°C. Dilute to a working concentration of 10-20 μg/mL in PBTx. |
| 3.5X-90X Stereo Zoom Inspection Industrial Microscope | AmScope | SM-1BNZ | Dissection scope. Equipped with 6W LED Dual Gooseneck Illuminator |
| ImageJ/Fiji | NIH | v1.51u | With SCF_MPI_CBG plugins (version 1.1.2) |
| FV1000-IX81 Confocal-laser Scanning Microscope | Olympus | ||
| Recombinant Construct | Bloomington Drosophila Stock Center | BL37749 |
References
- Erkkinen, M. G., Kim, M. -. O., Geschwind, M. D. Clinical Neurology and Epidemiology of the Major Neurodegenerative Diseases. Cold Spring Harbor perspectives in biology. , a033118 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671 (2012).
- Mauvezin, C., Ayala, C., Braden, C. R., Kim, J., Neufeld, T. P. Assays to monitor autophagy in Drosophila. Methods. 68 (1), 134-139 (2014).
- Weiss, K. R., Kimura, Y., Lee, W. -. C. M., Littleton, J. T. Huntingtin aggregation kinetics and their pathological role in a Drosophila Huntington’s disease model. Genetics. 190 (2), 581-600 (2012).
- Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (39), E5427-E5433 (2015).
- DeVorkin, L., Gorski, S. M. Monitoring autophagy in Drosophila using fluorescent reporters in the UAS-GAL4 system. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (9), (2014).
- Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. Journal of visualized experiments: JoVE. (37), (2010).
- Sweeney, S. T., Hidalgo, A., de Belle, J. S., Keshishian, H. Dissection of adult Drosophila brains. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2011).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. Formaldehyde fixation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 845-853 (1985).
- Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development. Trends in neurosciences. 24 (5), 251-254 (2001).
- Fischbach, K. -. F., Dittrich, A. The optic lobe of Drosophila melanogaster. I. A Golgi analysis of wild-type structure. Cell and tissue research. 258 (3), 441-475 (1989).
- Ruan, K., Zhu, Y., Li, C., Brazill, J. M., Zhai, R. G. Alternative splicing of Drosophila Nmnat functions as a switch to enhance neuroprotection under stress. Nature Communications. 6, 10057 (2015).
- Zhai, R. G., et al. NAD synthase NMNAT acts as a chaperone to protect against neurodegeneration. Nature. 452 (7189), 887 (2008).
- Li, C., et al. Spermine synthase deficiency causes lysosomal dysfunction and oxidative stress in models of Snyder-Robinson syndrome. Nat Commun. 8 (1), 1257 (2017).
- Prokop, A., Meinertzhagen, I. A. Development and structure of synaptic contacts in Drosophila. Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 20-30 (2006).
- Maday, S., Holzbaur, E. L. Autophagosome biogenesis in primary neurons follows an ordered and spatially regulated pathway. Dev Cell. 30 (1), 71-85 (2014).
- Mizushima, N., Yamamoto, A., Matsui, M., Yoshimori, T., Ohsumi, Y. In vivo analysis of autophagy in response to nutrient starvation using transgenic mice expressing a fluorescent autophagosome marker. Molecular biology of the cell. 15 (3), 1101-1111 (2004).
- Lee, S., Sato, Y., Nixon, R. A. Primary lysosomal dysfunction causes cargo-specific deficits of axonal transport leading to Alzheimer-like neuritic dystrophy. Autophagy. 7 (12), 1562-1563 (2011).
- Vincent, L., Soille, P. Watersheds in digital spaces: an efficient algorithm based on immersion simulations. IEEE Transactions on Pattern Analysis & Machine Intelligence. (6), 583-598 (1991).
- Najman, L., Schmitt, M. Geodesic saliency of watershed contours and hierarchical segmentation. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence. 18 (12), 1163-1173 (1996).
- Shiber, A., Breuer, W., Ravid, T. Flow cytometric quantification and characterization of intracellular protein aggregates in yeast. Prion. 8 (3), 276-284 (2014).
- Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
