Mantenimiento de cultivos biológicos y medir la expresión génica en Aphis nerii: un sistema no-modelo de las interacciones planta-insecto
Summary
El pulgón Aphis nerii coloniza plantas muy defendido en la familia del dogbane (Apocyanaceae) y ofrece numerosas oportunidades para el estudio de las interacciones planta-insecto. Aquí, presentamos una serie de protocolos para el mantenimiento de la planta y el pulgón de las culturas y la generación y el análisis molecular y los datos de a. nerii– omic.
Abstract
Áfidos son excelentes modelos experimentales para una variedad de cuestiones biológicas que van desde la evolución de la simbiosis y el desarrollo de polyphenisms a preguntas alrededor de las interacciones de los insectos con sus plantas hospederas. Recursos genómicos están disponibles para varias especies de áfidos, y con los avances en la secuenciación de próxima generación, transcriptómicos estudios se se amplía a organismos no-modelo que carecen de genomas. Además, culturas de pulgón pueden ser recogidas del campo y criadas en el laboratorio para el uso en experimentos moleculares y el brecha entre los estudios ecológicos y genéticos. Por último, muchos pulgones se pueden mantener en el laboratorio en sus plantas del anfitrión favorito en ciclos de vida perpetuos, partenogénesis que permite comparaciones de reproducir asexualmente genotipos. Aphis nerii, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, proporciona uno de estos modelos para estudiar interacciones de insectos con plantas tóxicas usando experimentos de organismos y moleculares. Métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en la expresión diferencial del transcriptoma de invernadero y laboratorio, extracciones de DNA y RNA, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma montaje y anotación, Análisis y verificación de la qPCR de genes diferencialmente expresados son descritos y discutidos aquí.
Introduction
Los áfidos son insectos hemimetabolous, pequeño que colonizan en familias de diversas plantas en todo el mundo. Son distintivos para varias características, más en particular sus ciclos de vida complejos con partenogénesis cíclica y polyphenisms discreta y sus simbiosis nutricionales obligados con endosimbionte bacteriano o de levadura que suministrar nutrientes en el la dieta de savia de planta1. Mientras más áfidos son especialistas de planta huésped, algunas especies generalistas son importantes plagas, causando un daño económico considerable en los cultivos ya sea directamente o a través de los agentes patógenos y virus vector2. La publicación del primer genoma del pulgón en el 2010, el áfido de la arveja Acyrthosiphon pisum3, marcó un hito importante en el estudio de la biología de los áfidos porque proporcionó los recursos genomic para abordar preguntas acerca de los insectos adaptaciones al estilo de vida herbívora, los que podrían conducir a un mejor control estrategias4incluidos. Desde entonces, han acumulado más recursos genomic con la publicación de un genoma anotado para la soja pulgón glycines Aphis5y recursos disponibles al público todo el genoma de otra especie de pulgón tres (Myzus Cerasi (cereza negra pulgón), Myzus persicae (pulgón de patatas y melocotón), Rhopalosiphum padi (pulgón de la avena de la cereza de pájaro)6. Valiosa de novo transcriptómicos recursos está disponible, así como para un número de otras especies de áfidos (e.g.,Aphis gossypii (pulgón del algodón)7, Sitobion avenae (áfido grano)8, Cinara pinitabulaeformis (pulgón del pino)9, Aphis nerii (pulgón de la adelfa de algodoncillo)10).
Áfidos también han hecho contribuciones duraderas a nuestro entendimiento de las interacciones planta-insecto y la ecología de la vida en las plantas11. Un área donde los pulgones han hecho contribuciones especialmente importantes es en nuestra comprensión de la ecología química de las interacciones de la planta de host. Adaptaciones expresan diversos insectos herbívoros para superar las defensas de la planta y algunos incluso cooptación las defensas de la planta para su propio benefician de12,13,14. Por ejemplo, el pulgón de la adelfa de algodoncillo, Aphis nerii, es un brillante amarillo, invasor pulgones encontrados en regiones templadas y tropicales en todo el mundo que colonizan en las plantas de la familia del algodoncillo (Apocynaceae). Planta de la familia Apocynaceae ha desarrollado defensas químicas diversas, incluyendo látex lechoso y glucósidos cardíacos conocidos como cardenolides, que se unen el portador de catión Na, K-ATPasa y son eficaces elementos de disuasión a generalistas herbívoros15, 16. especialistas de algodoncillo expresan distintos modos de resistencia a los cardenolides, y selectivamente o pasivamente se acumulan o modificar cardenolides en sus tejidos como medio para disuadir depredadores o para otros beneficios17. A. nerii piensa secuestrar cardenolides de esta manera, aunque los mecanismos y beneficios funcionales siguen siendo claro10,18.
Teniendo en cuenta los recursos genomic a la mano, a. nerii ofrece un excelente modelo experimental para el estudio de los mecanismos moleculares y genéticos involucrados en las interacciones chemo-ecológicas entre las plantas tóxicas acogida y su especialista herbívoros. Cabe señalar que, mientras algunos de los primeros estudios de a. nerii se centró en el secuestro de cardenolides19, desde entonces, los estudios de a. nerii han proporcionado penetraciones en un amplio conjunto de preguntas evolutivas y ecológicas, incluyendo la estructura genética de insectos invasores20 y la interacción entre regulación ascendente y descendente de la densidad de herbívoros21. A. nerii así es un buen candidato como un modelo experimental para un conjunto especialmente amplio de estudios de las interacciones planta insecto. Crítico para el éxito de cualquier estudio con a. nerii es la cultura de cuidado del pulgón las poblaciones, que incluye el cultivo de plantas de las que dependen los pulgones, así como una eficiente generación de datos de alta calidad – omic. Nuestro objetivo es guiar al lector a través de ambos. A continuación figuran los métodos para la generación y mantenimiento de la planta y pulgón en invernadero y laboratorio, DNA y RNA extracciones, análisis de microsatélites, de novo transcriptoma conjunto y anotación, transcriptoma Análisis de expresión diferencial y verificación de la qPCR de diferencialmente expresan genes. Mientras que estos métodos se escriben de a. nerii, los métodos generales de cultivo, la extracción y el análisis se pueden extender a una gran variedad de especies de áfidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante mucho tiempo se ha reconocido que la catalogada a. nerii puede proporcionar penetraciones en los patrones y mecanismos de resistencia a las defensas de la planta y secuestro particularmente química18,37. Recientemente ha surgido una serie de recursos genómicos de a. nerii10, ofreciendo nuevas oportunidades para estudios de genómica funcionales y ecológicos que usan a. nerii como modelo. Describiremos …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a Michelle Moon (Vanderbilt University) por asistencia con la fotografía. Proporcionado la Universidad de Vanderbilt a PA y SSLB se admiten por DGE-1445197.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
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